施劍明，殷嫦嫦，孫維君，杜桂花，林思文，謝榮輝，耿書國，汪建樣，殷 明

（南昌大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院、2.研究生院醫(yī)學(xué)部，江西 南昌 330006；3.九江學(xué)院，江西 九江 332000）

槲皮素（quercetin，Qu）是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于植物的花、葉、果實中，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及保護心血管等作用［1］。近年來其在抗腫瘤方面的作用成為了研究熱點，具有抗腫瘤范圍廣、價格低廉、對正常細(xì)胞幾乎無毒副作用等優(yōu)點［2］。已有研究報道［3-4］Qu具有抗骨肉瘤細(xì)胞作用，本研究將聯(lián)合應(yīng)用Qu與順鉑（cisplatin，CDDP）作用于MG-63細(xì)胞，觀察其對MG-63細(xì)胞增殖及凋亡的影響，通過Chou-Talaly聯(lián)合指數(shù)法分析兩藥之間是否具有協(xié)同效應(yīng)，并初步探討其作用機制，為Qu運用于骨肉瘤的臨床治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株（由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷研究所饋贈，本實驗室凍存儲備）。

1.1.2 藥品與試劑 槲皮素（美國Sigma）；順鉑注射液（江蘇豪森藥業(yè)）；高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone公司）；引物合成（南京金斯瑞生物科技有限公司）；兔抗人 β-actin、Bcl-2、cleaved caspase-3多克隆抗體（美國 Proteintech）；DMSO、ANNEXIN VFITC凋亡檢測試劑盒（北京Solarbio公司）；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）；GREENspin細(xì)胞RNA快速提取試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、HiFi-MMLV cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；2×Taq Master Mix（上海欣百諾生物科技有限公司）；總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.1.3 儀器 倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；PCR基因擴增儀（西安天隆科技有限公司）；Mini水平電泳槽、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽、酶標(biāo)儀-Model680（美國BIO-RAD公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)、CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國SIM公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期MG-63細(xì)胞，常規(guī)消化后，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，按5×104／孔，接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合約70%后加藥。實驗設(shè)：①不同濃度Qu組（分別給予10、20、40、80、160μmol·L-15個濃度處理）；② 不同濃度 CDDP組（分別給予 1.5625、3.125、6.25、12.5、25μmol·L-15個濃度處理）；③ 不同濃度聯(lián)合組（按兩組單藥濃度梯度依次平行組合）；④對照組（藥物濃度為0）；其中各組DMSO濃度均控制在0.1%。作用1、2、3 d后觀察細(xì)胞形態(tài)及密度的變化情況。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期MG-63細(xì)胞，常規(guī)消化后，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度按5×103／孔，接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合約70%后加藥。按上述濃度設(shè)置將不同濃度的Qu、CDDP單獨及聯(lián)合加入各孔，每個濃度梯度設(shè)4個平行孔及藥物空白孔（去除藥物溶液自身顏色對測定的影響），并設(shè)添加0.1%DMSO完全培養(yǎng)基的對照組，作用48 h后每孔加入20μl CCK-8，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后，取出在酶標(biāo)儀450 nm處測定其吸光度值（A），以藥物空白孔進行調(diào)零，根據(jù)計算公式：細(xì)胞增殖抑制率／%計算不同濃度Qu與CDDP單獨及聯(lián)合對細(xì)胞的抑制率，并計算各組藥物的半數(shù)抑制率濃度IC50。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期MG-63細(xì)胞常規(guī)消化后，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度按1×105／孔，接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合約70%后加藥。實驗設(shè)對照組（含0.1%DMSO，藥物濃度為0）、Qu組（含0.1%DMSO及IC50Qu）、CDDP組（含0.1%DMSO及 IC50CDDP）、Qu+CDDP組（含0.1%DMSO、IC50Qu及 IC50CDDP），其中 IC50為藥物作用48 h后的半數(shù)抑制率濃度。藥物作用細(xì)胞48 h后，常規(guī)消化調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)1×109·L-1，取1 ml細(xì)胞懸液，用預(yù)冷PBS洗滌離心2遍，加入200 μl Binding Buffer，然后加入 10μl Annexin V-FITC，室溫避光反應(yīng)15 min后加入300μl Binding Buffer，上機前5 min加入10μl PI，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。分布于散點圖左下象限散點代表正常細(xì)胞，右下象限的散點代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限的散點代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，左上象限散點代表細(xì)胞碎片。

1.2.4 RT-PCR檢測凋亡相關(guān)分子基因表達(dá)水平細(xì)胞種板及藥物分組與流式細(xì)胞儀檢測凋亡率相同，藥物作用48 h后，按GREENspin細(xì)胞RNA快速提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，按HiFi-MMLV cDNA第1鏈合成試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后按2×Taq Master Mix說明書進行PCR擴增，擴增后DNA樣本用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。采用SIM凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行照相，Image-Proplus6.0軟件進行灰度分析。反應(yīng)所需引物序列為 β-actin：上游CGGGAAATCGTGCGTGAC-′，下游′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，產(chǎn)物大小 443 bp；Bcl-2：上游′-ACCTTCATCAGGGGGTG-′，下游′-TGCCAGTGGTCACACG-3′，產(chǎn)物大小 122 bp；caspase-3：上游 5′-CATGATTAGCAAGTTACAGTGATGC-3′，下 游 5′-CACAGTCTTAAGTGGGGGGA-3′，產(chǎn)物大小 110 bp。

1.2.5 Western blot檢測凋亡相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞種板及藥物分組與流式細(xì)胞儀檢測凋亡率相同，藥物作用48 h后，按總蛋白提取試劑盒說明書提取各組總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，每孔蛋白上樣30μg，進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST稀釋一抗（β-actin 1∶4 000，Bcl-2 1∶1 000，cleaved caspase-3 1∶800）4℃孵育過夜，次日5%脫脂牛奶稀釋，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，于暗室按高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒說明書滴加發(fā)光工作液，暗盒中膠片曝光，顯影、定影后用相機拍照，采用Image-Proplus 6.0軟件進行灰度分析。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理及藥物聯(lián)合作用分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計處理，所有數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用單因素方差分析，并通過Scheffe檢驗進行兩兩比較。藥物聯(lián)合作用分析：采用Chou-Talaly聯(lián)合指數(shù)法進行判斷［5］，根據(jù)中效方程式 fa／fu＝（D／Dm）m（其中 fa為藥物作用效應(yīng)，D為藥物濃度，Dm為中效濃度IC50），兩邊取對數(shù)得lg（fa／fu）＝mlgD-mlgDm，設(shè) y＝lg（fa／fu），x＝lgD，a＝-mlgDm，m＝b由此得到直線方程式：y＝bx+a，可做出兩藥單獨及聯(lián)合作用時的中效圖形，并計算相關(guān)系數(shù)γ，得出m及Dm，再計算出兩藥單獨及聯(lián)合作用在各效應(yīng)所需藥物濃度 D＝Dm（fa／fu）1／m。最后計算兩藥聯(lián)合作用在各效應(yīng)（fa）的合用指數(shù)（Combination index，CI），CI＝D1／DX1+D2／DX2+α*D1D2／DX1DX2，其中 D1、D2為兩藥聯(lián)合作用產(chǎn)生 X效應(yīng)時兩藥各自所需濃度，DX1、DX2為兩藥單獨作用產(chǎn)生X效應(yīng)時兩藥各自濃度，α為常數(shù)，當(dāng)兩藥聯(lián)合作用相互排斥時為0，當(dāng)兩藥物聯(lián)合作用相互非排斥時為1。Qu和CDDP相互作用為非排斥性，故α＝1。CI＜1，兩藥聯(lián)合呈協(xié)同效應(yīng)；CI＝1，兩藥聯(lián)合呈疊加效應(yīng)；CI＞1兩藥聯(lián)合呈拮抗效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 對照組MG-63細(xì)胞增殖良好，Qu組及CDDP組細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞形態(tài)由梭形變圓、變小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒增大增粗，并可見少量凋亡小體，少量細(xì)胞逐漸脫落、裂解，呈典型凋亡形態(tài)改變，聯(lián)合組凋亡現(xiàn)象更加明顯。上述現(xiàn)象隨著作用時間的延長及藥物濃度的增加而增強（Fig 1）。

Fig 1 Cellular morphology observation（×100）A：0.1%DMSO for 48 h；B：40μmol·L-1 Qu for 48 h；C：6.25μmol·L-1 CDDP for 48 h；D：40μmol·L-1 Qu combined with 6.25μmol·L-1 CDDP for 48 h.

2.2 細(xì)胞增殖活力檢測及藥物聯(lián)合作用分析結(jié)果

Qu、CDDP單獨及聯(lián)合均對MG-63細(xì)胞增殖有抑制作用（P＜0.05），且隨著藥物濃度的增加抑制作用增強；與兩藥單獨作用相比較，聯(lián)合作用更加明顯（P＜0.05）（Tab 1）。在中效方程中，通過 y＝bx+a直線回歸方程可得到Fig 2中的中效圖形，并計算出Tab 2中的相關(guān)數(shù)據(jù)，最后得到Qu與CDDP聯(lián)合在不同效應(yīng)（fa）時的合用指數(shù)（CI），繪制出量效曲線（fa-CI）（Fig 3），Qu與 CDDP聯(lián)合幾乎在整個效應(yīng)范圍內(nèi)（0.1～0.9）都存在CI＜1，表明Qu與CDDP聯(lián)合呈明顯協(xié)同效應(yīng)。

Tab 1 Inhibiton ratios of Qu alone or combined w ith CDDP on grow th of MG-63 cell

Tab 1 Inhibiton ratios of Qu alone or combined w ith CDDP on grow th of MG-63 cell

*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs Qu alone at the same concentration gradient；△P＜0.05 vs CDDP alone at the same concentration gradient.

Concentration gradient Qu Concentration／μmol·L-1 Inhibitory Inhibitory Inhibitory ratio／%CDDP Concentration／μmol·L-1ratio／%Qu+CDDP Concentration／μmol·L-1ratio／%0 0 0 0 0 0 0 10 8.80±2.87* 1.5625 7.02±1.94* 10±1.5625 30.07±6.58*#△2 20 13.47±1.87* 3.125 10.91±1.26* 20±3.125 48.78±3.31*#△3 40 39.64±2.73* 6.25 22.83±2.40* 40±6.25 62.92±2.34*#△4 80 61.58±1.68* 12.5 55.01±1.59* 80±12.5 87.42±3.80*#△5 160 72.61±4.31* 25 71.71±1.18* 160±25 90.20±2.38*#1△

Tab 2 m，Dm andγof Qu alone or combined w ith CDDP

Fig 2 M edian-effect graph of Qu alone or combined w ith CDDP

Fig 3 Curve of fa and CI after treated with Qu and CDDP（fa-CI）

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果 Qu組及CDDP組細(xì)胞早期凋亡率分別為（4.96±1.14）%、（8.44±0.72）%，與對照組（0.81±0.34）%的細(xì)胞早期凋亡率比較有所升高（P＜0.05），而Qu+CDDP組細(xì)胞早期凋亡率高于對照組及各單藥組（P＜0.05），為（11.52±1.09）%（Fig 4）。

2．4 凋亡相關(guān)分子mRNA含量檢測結(jié)果 RTPCR檢測結(jié)果灰度分析表明：Qu和CDDP作用后均可下調(diào)Bcl-2及上調(diào)caspase-3基因表達(dá)水平（P＜0.05），而 Qu+CDDP作用時變化更加明顯（P＜0.05）（Fig 5）。

Fig 4 Apoptosis ratios of MG-63 cells in different groupControl：0.1%DMSO；Qu：65.35μmol·L-1；CDDP：12.70 μmol·L-1；Qu+CDDP：65.35μmol·L-1 Qu combined with 12.70 μmol· L-1 CDDP.The apoptosis ratios of MG-63 cells in different groups were analyzed by flow cytometry after48 h.*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs Qu；△P＜0.05 vs CDDP.

2.5 凋亡相關(guān)分子蛋白含量檢測結(jié)果 Westernblot檢測凋亡相關(guān)分子 Bcl-2、cleaved caspase-3（caspase-3活性片段）蛋白水平變化與基因水平變化一致（Fig 6）。

3 討論

CDDP是骨肉瘤化療方案中的一線用藥，是一種以濃度決定療效的藥物，然而長時間大劑量使用可造成嚴(yán)重毒性積累以及內(nèi)在性和獲得性耐藥等問題，很大程度上限制了其大量使用。尋找一種無毒或低毒的中藥成分，與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，利用兩者之間的協(xié)同效應(yīng)，在保證化療藥物殺滅腫瘤細(xì)胞效果的同時降低化療藥物的使用劑量，從而減小藥物的毒副作用及延緩耐藥的產(chǎn)生，是近年來研究的熱點。Qu是目前已知的最強的中藥抗癌有效成分之一，對肺癌細(xì)胞［6］、乳腺癌細(xì)胞［7］、胃癌細(xì)胞［8］、白血病細(xì)胞［9］、肝癌細(xì)胞［10］等多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用。然而Qu聯(lián)合CDDP是否具有協(xié)同抗骨肉瘤作用尚未見報道。

Fig 5 Gene expression of Bcl-2 and caspase-3 indifferent groupControl：0.1%DMSO；Qu：65.35μmol·L-1；CDDP：12.70 μmol·L-1；Qu+CDDP：65.35μmol·L-1 Qu combined with 12.70 μmol·L-1 CDDP.The gene expression of Bcl-2 and caspase-3 was detected by RT-PCR assay after 48 h.*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs Qu；△P＜0.05 vs CDDP.

Fig 6 Protein expression of Bcl-2 and cleaved caspase-3 in different groupControl：0.1%DMSO；Qu：65.35μmol·L-1；CDDP：12.70 μmol·L-1；Qu+CDDP：65.35μmol·L-1 Qu combined with 12.70 μmol·L-1 CDDP.The protein expression of Bcl-2 and cleaved caspase-3 wasmeasured by Western blot assay after 48 h.*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs Qu；△P＜0.05 vs CDDP.

本文采用的Chou-Talaly聯(lián)合指數(shù)法是基于質(zhì)量作用定律的中效原理提出的，目前已在國際上被廣泛應(yīng)用于腫瘤等領(lǐng)域藥物聯(lián)合分析［11］，具有周期短，操作相對簡單，結(jié)果明確，應(yīng)用MTT或CCK-8實驗所得結(jié)果就可以進行分析等優(yōu)點。本實驗分析結(jié)果顯示，Qu、CDDP聯(lián)合對骨肉瘤增殖抑制作用在不同效應(yīng)水平（0.1～0.9）均呈協(xié)同效應(yīng)，提示槲皮素可作為CDDP輔助用藥用于骨肉瘤的臨床化療。

槲皮素抗腫瘤的機制呈多樣性，主要包括：抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、影響腫瘤細(xì)胞代謝和抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等［12］，其中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是最主要的機制之一，其中涉及到許多抗凋亡基因和促凋亡基因。Bcl-2是公認(rèn)的抗凋亡基因，具有穩(wěn)定線粒體外膜的作用，主要通過阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用［13］。譚君等［14］研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過下調(diào) survivin、Bcl-2蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡。Kim等［15］用槲皮素處理結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞后，同樣檢測到Bcl-2表達(dá)下降。Caspase家族是引起細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)和生物學(xué)改變的關(guān)鍵執(zhí)行者，所引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)，其中caspase-3是核心效應(yīng)器［16］，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號刺激后，無活性前體pro-caspase-3被激活剪切，形成活性片段cleaved caspase-3，后者再瀑布式激活下游的caspase蛋白酶家族，進一步參與切割多種死亡底物，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。顧超等［17］研究槲皮素誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡實驗中，證實其能夠通過活化caspase-3、caspase-8促進細(xì)胞凋亡，且存在明顯的時間依耐性。譚君等［18］還發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過下調(diào)survivin蛋白的表達(dá)，直接激活caspase-3而誘導(dǎo)肝癌SMMC7721細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示槲皮素和順鉑作用MG-63細(xì)胞后，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而caspase-3表達(dá)上調(diào)，聯(lián)合用藥變化較單獨用藥更加明顯，從而推測槲皮素聯(lián)合順鉑協(xié)同抗骨肉瘤作用機制可能與相互增強下調(diào)Bcl-2及上調(diào)caspase-3等凋亡相關(guān)分子的表達(dá)有關(guān)。

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