陸翠林，張 旋，詹金彪，楊柳萌，鄭永唐

（1.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，中國(guó)科學(xué)院和云南省動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650223；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系，浙江 杭州 310058）

人類免疫缺陷病病毒1（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）感染宿主細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程，HIV-1整合酶在其中發(fā)揮重要作用。整合酶通過3′端加工（3′-processing，3′-P）和鏈轉(zhuǎn)移（strand transfer，ST）功能，將病毒 cDNA整合到宿主細(xì)胞基因組上［1］。HIV-1整合酶特異性識(shí)別HIV-1 cDNA長(zhǎng)末端重復(fù)序列 （LTR）3′端CAGT堿基，并剪切GT堿基的過程稱為整合酶3′端加工活性［2］，抑制整合酶3′端加工活性能有效地抑制HIV-1病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制。目前用于整合酶3′端加工抑制劑篩選的方法主要有：放射自顯影［3］、時(shí)間分辨熒光、熒光共振能量轉(zhuǎn)移［4］等。放射自顯影法存在放射性污染，時(shí)間分辨熒光則需要特殊檢測(cè)儀器，這二種方法都不易普及；熒光共振能量轉(zhuǎn)移在液相環(huán)境中進(jìn)行，能更好地模擬體內(nèi)整合酶活性，檢測(cè)儀器相對(duì)簡(jiǎn)單，同時(shí)保留了熒光檢測(cè)技術(shù)靈敏度高的特點(diǎn)。

本文采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，利用文獻(xiàn)報(bào)道［5］設(shè)計(jì)的3′端加工底物，通過考察檢測(cè)波長(zhǎng)、緩沖液配方、整合酶和底物濃度、金屬離子等因素，建立并優(yōu)化整合酶3′端加工活性檢測(cè)方法，用陽性藥物雷特格韋和楊梅黃素進(jìn)行驗(yàn)證，采用建立的方法檢測(cè)了25個(gè)細(xì)胞水平具有抗HIV-1活性但靶點(diǎn)不明確的化合物對(duì)整合酶3′端加工的影響，篩選到2個(gè)具有較強(qiáng)抑制整合酶3′端加工活性的抑制劑，為抗HIV新化合物的后續(xù)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 反應(yīng)底物 DS-1：5′-［FAM］-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CGTGGA AAA TCTCTA GCA GT-［DABCYL］-3′［5］由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和修飾。

1.2 主要試劑和材料 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazinyl ethanesulfonic acid，HEPES）、聚乙二醇8000（polyethylene glycol 8000，PEG-8000）、氯化錳（manganese chloride，MnCl2）、氯化鎂（magnesium chloride，MgCl2）為Sigma公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）為Merck公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）為Roche公司產(chǎn)品；三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、甘油（Glycerol）為AMRESCO產(chǎn)品；HCl為西隴化工股份有限公司產(chǎn)品；脫氧核糖核酸酶I（DNase I）為 TaKaRa產(chǎn)品；HIV-1整合酶（HIV-1 integrase，HIV-1 IN）購(gòu)自XpressBio公司或由浙江大學(xué)詹金彪老師惠贈(zèng)；雷特格韋（Raltegravir）購(gòu)自Selleckchem公司；楊梅黃素（Myricetin）購(gòu)自北京新宏偉博科技有限公司；96孔黑色酶標(biāo)板為美國(guó)Corning產(chǎn)品。

1.3 反應(yīng)底物的制備［6］將帶標(biāo)記的反應(yīng)底物DS-1用滅菌水配制成濃度為100μmol·L-1的溶液，沸水浴中煮沸5 min，緩慢冷卻至室溫后分裝，-20℃避光保存。

1.4 反應(yīng)底物最適檢測(cè)波長(zhǎng)確定 用過量DNase I切割反應(yīng)底物，固定激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，檢測(cè)不同發(fā)射波長(zhǎng)條件下底物產(chǎn)生的熒光增量，以最大熒光增量條件下的波長(zhǎng)為最適發(fā)射波長(zhǎng)；固定發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，檢測(cè)不同激發(fā)波長(zhǎng)條件下底物產(chǎn)生的熒光增量，以最大熒光增量條件下的波長(zhǎng)為最適激發(fā)波長(zhǎng)。

1．5 HIV-1整合酶3′端加工檢測(cè)方法的建立 反應(yīng)在96孔黑色酶標(biāo)板上進(jìn)行，每孔加入2×反應(yīng)緩沖液50μl，依次加入滅菌水、反應(yīng)底物和整合酶，使反應(yīng)體系為100μl，同時(shí)設(shè)置不含整合酶的對(duì)照孔，37℃孵育。每隔1 h，檢測(cè)1次熒光值。計(jì)算不同反應(yīng)條件下底物熒光值的變化，底物熒光增量最大的反應(yīng)條件即為檢測(cè)整合酶3′端加工的較優(yōu)條件。

1．6 HIV-1整合酶3′端加工抑制劑篩選 將待測(cè)化合物在96孔黑色酶標(biāo)板上5倍倍比稀釋，同時(shí)設(shè)置含有抑制劑的陽性藥物對(duì)照與不含抑制劑的陰性對(duì)照。每孔加入2×反應(yīng)緩沖液50μl，混勻后，加入整合酶，37℃孵育30 min后加入反應(yīng)底物，檢測(cè)熒光值。37℃反應(yīng)6 h后再次檢測(cè)熒光值。計(jì)算不同濃度條件下待測(cè)化合物對(duì)HIV整合酶3′端加工活性的抑制作用。計(jì)算公式為：抑制率／%＝（1-實(shí)驗(yàn)孔熒光增量／對(duì)照孔熒光增量）×100%。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)底物最適檢測(cè)波長(zhǎng)確定 當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)固定為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm時(shí)檢測(cè)到的熒光值最高，此時(shí)本底值也相對(duì)較低（Fig 1A）；當(dāng)發(fā)射波長(zhǎng)固定為525 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為495 nm時(shí)熒光值最高，此時(shí)本底值接近零（Fig 1B）。綜合Fig 1的結(jié)果，最后確定反應(yīng)底物檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

Fig 1 Determ ining testing wavelength of HIV-1 integrase 3′-processingA：Detection range of emission wavelength was from 500 nm to 550 nm when fixed excitation wavelength on 490 nm；B：Detection range of excitation wavelength was from 470nm to 500 nm when fixed emission wavelength on 525 nm

2.2 緩沖液確定 過量DNase I切割不同濃度的反應(yīng)底物，根據(jù)切割前后熒光值的變化，確定反應(yīng)底物最低使用濃度為100 nmol·L-1。固定整合酶濃度為1.6μmol·L-1，底物濃度為100 nmol·L-1，在整合酶過量的條件下檢測(cè)3種不同的緩沖液［7］在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)整合酶3′端加工活性的影響。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)緩沖液 1〔80 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5），20 mmol·L-1DTT，10 mmol·L-1MgCl2，0.2 g·L-1BSA〕和緩沖液3〔50mmol·L-1HEPES（pH 7.5），20mmol·L-1DTT，10 mmol·L-1MgCl2，10%PEG8000〕可促進(jìn)整合酶3′端加工活性（Fig 2A、2C），這2種緩沖液條件下反應(yīng)熒光值隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且緩沖液1條件下反應(yīng)熒光增量高于緩沖液3條件下的熒光增量，即緩沖液1效果優(yōu)于緩沖液3；而緩沖液2〔50 mmol·L-1HEPES（pH 7.5），10 mmol·L-1DTT，10 mmol·L-1MgCl2，20% 甘油〕存在條件下熒光增量反而出現(xiàn)負(fù)值（Fig 2B），不適于作為檢測(cè)整合酶3′端加工活性的緩沖液。

Fig 2 Effects of 3 buffers on integrase 3′-processing（n＝3）A：Buffer 1；B：Buffer 2；C：Buffer 3

2.3 整合酶濃度和底物濃度的確定 整合酶以二聚體的形式發(fā)揮3′端加工作用，體外檢測(cè)整合酶3′端活性加工時(shí)，整合酶與底物的濃度比在2∶1～70∶1的范圍內(nèi)比較合適［8］。當(dāng)DS-1濃度為100 nmol·L-1時(shí)，底物的熒光值隨著整合酶濃度的升高而升高，當(dāng)整合酶濃度達(dá)到3.2μmol·L-1時(shí)，底物熒光增量達(dá)到峰值，繼續(xù)增高整合酶的濃度，熒光增量反而降低（Fig 3A），可能是因?yàn)楦邼舛鹊恼厦笗?huì)發(fā)生聚集，從而影響其活性［8］。

為了降低整合酶的使用濃度，固定整合酶濃度為1μmol·L-1，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)熒光增量與底物濃度呈線性關(guān)系，當(dāng)整合酶濃度為1μmol·L-1，底物濃度為500 nmol·L-1時(shí)，整合酶3′端加工活性最強(qiáng)（Fig 3B）。

Fig 3 Effects of integrase and substrate on integrase 3′-processing（n＝3）A：integrase（IN）；B：substrate DS-1

2.4 金屬離子的選擇以及使用濃度的確定 使用緩沖液1時(shí)，整合酶3′端加工活性隨著鎂離子濃度的升高而升高，當(dāng)鎂離子濃度高于20 mmol·L-1時(shí)，整合酶的活性趨于穩(wěn)定（Fig 4A）；低濃度錳離子對(duì)整合酶3′端加工活性的促進(jìn)作用高于高濃度錳離子的促進(jìn)作用（Fig 4B），且緩沖液1條件下，鎂離子對(duì)整合酶3′端加工活性的促進(jìn)作用強(qiáng)于錳離子。

2.5 整合酶3′端加工反應(yīng)條件 根據(jù)“2.1-2.4”實(shí)驗(yàn)結(jié)果，較優(yōu)的整合酶3′端加工反應(yīng)條件匯總?cè)鏣ab 1所示。

Tab 1 Reaction conditions of integrase3′-processing in vitro

2.6 整合酶3′端加工抑制劑篩選方法的驗(yàn)證 利用陽性藥物雷特格韋［9］和楊梅黃素［5］對(duì)已經(jīng)優(yōu)化建立的整合酶3′端加工抑制劑篩選方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：雷特格韋和楊梅黃素能有效地抑制整合酶3′端加工活性，其抑制的IC50分別為197.24μmol·L-1（Fig 5A）和 18.75μmol·L-1（Fig 5B）。表明優(yōu)化建立的方法可適用于整合酶3′端加工抑制劑的篩選。

2.7 整合酶3′端加工抑制劑的篩選 利用優(yōu)化建立的方法檢測(cè)了25個(gè)細(xì)胞水平具有抗HIV-1活性但靶點(diǎn)不明確的化合物對(duì)整合酶3′端加工的抑制作用，共發(fā)現(xiàn)10個(gè)化合物具有一定抑制作用，其中化合物6、7對(duì)整合酶3′端加工抑制的IC50值為 41.55 mg·L-1（Fig 6A）、56.69 mg·L-1（Fig 6B）。它們?cè)诩?xì)胞水平抗 HIV-1活性［10-13］的治療指數(shù)分別為6464.04、5933.85，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗HIV-1活性。

3 討論

目前整合酶3′端加工抑制劑篩選的方法中，放射自顯影和時(shí)間分辨熒光存在一定的局限性，不易普及，熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理方法則具有較好的優(yōu)勢(shì)。本研究利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理建立的方法，與文獻(xiàn)［5］報(bào)道建立的方法相比有以下幾點(diǎn)不同：（1）本研究對(duì)一定波長(zhǎng)范圍的發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為495 nm／525 nm，該條件下的熒光增量比485 nm／535 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的熒光增量更高，可提高檢測(cè)靈敏度。（2）體內(nèi)整合酶結(jié)合鎂離子而發(fā)揮活性［1］，體外整合酶一般與錳離子結(jié)合后的活性強(qiáng)于與鎂離子結(jié)合后的活性［3，5-6］，所以體外實(shí)驗(yàn)中一般選用錳離子作為金屬輔助離子。當(dāng)緩沖液成分不同時(shí)，鎂離子或錳離子對(duì)整合酶3′端加工活性的影響不同［8］。我們采用3種不同的緩沖液，檢測(cè)緩沖液成分對(duì)整合酶活性的影響，確定了較佳的緩沖液配方，同時(shí)檢測(cè)了該緩沖液條件下這2種金屬離子對(duì)整合酶3′端加工活性的影響，最終確定選用20 mmol·L-1的鎂離子整合酶3′端加工活性最強(qiáng)。反應(yīng)中使用鎂離子能更好地模擬體內(nèi)整合酶活性。（3）當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 nmol·L-1和整合酶濃度為3.2μmol·L-1條件下，整合酶3′端加工活性最強(qiáng)，但整合酶的復(fù)性是難題，高用量增加了檢測(cè)成本。整合酶濃度為800～3200 nmol·L-1時(shí)熒光增量隨著酶濃度的升高而升高，所以我們檢測(cè)了酶濃度為1μmol·L-1時(shí)整合酶3′端加工活性與底物濃度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)低濃度整合酶、高濃度底物不影響檢測(cè)靈敏度。最終整合酶的用量從文獻(xiàn)［5］的 1.56μmol·L-1降至 1μmol·L-1，節(jié)約了酶用量。（4）楊梅黃素對(duì)整合酶3′端加工抑制的 IC50為18.75 μmol·L-1，檢測(cè)結(jié)果與 Tramontano等［14］用 40個(gè)堿基的DNA作為整合酶3′端加工的底物時(shí)檢測(cè)到的楊梅黃素的IC50值為（13±1.6）μmol·L-1接近，而與 He等［5］的結(jié)果（5.6μmol·L-1）略有差異，這可能是由于使用不同的金屬離子造成的。

Fig 4 Effects ofmetal ions on integrase 3′-processing（n＝3）A：MgCl2；B：MnCl2

Fig 5 Inhibition of raltegravir and myricetin on integrase 3′-processing（n＝5）A：Raltegravir；B：Myricetin

Fig 6 Screening of HIV-1 integrase 3′-processing inhibitor（n＝3）A：inhibition of compound 6 on integrase 3′-processing；B：inhibition of compound 7 on integrase 3′-processing.

綜上所述，我們成功地建立并優(yōu)化了整合酶3′端加工抑制劑篩選方法，金屬離子使用鎂離子，能更好地模擬整合酶在體內(nèi)的反應(yīng)條件，有助于有效的整合酶3′端加工抑制劑的篩選。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Engelman A，Cherepanov P.The lentiviral integrase binding protein LEDGF／p75 and HIV-1 replication［J］.PLoS Pathog，2008，4（3）：1-9.

［2］ Poeschla E M.Integrase，LEDGF／p75 and HIV replication［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65（9）：1403-24.

［3］ Rank K B，F(xiàn)an N，Sharma SK，etal.A rapid and quantitative assay for inhibition of 3′cleavage activity of HIV-1 integrase［J］.Antiviral Res，1997，36（1）：27-33.

［4］ 張 旋，楊柳萌，鄭永唐.HIV-1整合酶抑制劑體外篩選方法研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（1）：14-7.

［4］ Zhang X，Yang LM，Zheng Y T.Advances of screeningmethods in vitro for HIV-1 integrase inhibitors［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（1）：14-7.

［5］ He H Q，Ma X H，Liu B，et al.High-throughput real-time assay based onmolecular beacons for HIV-1 integrase3′-processing reaction［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28（6）：811-7.

［6］ Hazuda D J，Hasting JC，Wolfe A L，et al.A novel assay for the DNA strand-transfer reaction of HIV-1 integrase［J］.Nucleic Acids Res，1994，22（6）：1121-2.

［7］ Engelman A，Craigie R.Efficientmagnesium-dependenthuman immunodeficiency virus type 1 integrase activity［J］.JVirol，1995，69（9）：5908-11.

［8］ Smolov M，Gottikh M，Tashlitskii V，et al.Kinetic study of the HIV-1 DNA 3′-end processing［J］.FEBSJ，2006，273（6）：1137-51.

［9］ Anisenko A，Agapkina J，Zatsepin T，et al.A new fluorometric assay for the study of DNA-binding and 3′-processing activities of retroviral integrases and itsuse for screening of HIV-1 integrase inhibitors［J］.Biochimie，2012，94（11）：2382-90.

［10］鄭永唐.抗HIV藥物的體外篩選和研究方法［J］.中國(guó)新藥雜志，2002，11（8）：596-600.

［10］Zheny Y T.In vitro screening and assays for anti-HIV agents［J］.Chin JNew Drugs，2002，11（8）：596-600.

［11］Zheng Y T，ZhangW F，Ben K L，et al.In vitro immunotoxicity and cytotoxicity of trichosanthin againsthuman normal immunocytes and leukemia-lymphoma cells［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，1995，17（1）：69-79.

［12］Zhang G H，Wang Q，Chen J J，et al.The anti-HIV-1 effect of scutellarin［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，334（3）：812-6.

［13］Wang JH，Tam SC，Huang H，etal.Site-directed PEGylation of trichosanthin retained its anti-HIV activity with reduces potency in vitro［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，317（4）：965-71.

［14］Tramontano E，Onidi L，Esposito F，et al.The use of a new in vitro reaction substrate reproducing both U3 and U5 regions of the HIV-1 3′-ends increases the correlation between the in vitro and in vivo effects of the HIV-1 integrase inhibitors［J］.Biochem Pharmacol，2004，67（9）：1751-61.