王本極 潘嘉林 黃曉燕 施翔翔 程碧環(huán) 金勝威 楊德業(yè)

●論著

FXYD5基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能的初步研究

王本極 潘嘉林 黃曉燕 施翔翔 程碧環(huán) 金勝威 楊德業(yè)

目的構(gòu)建大鼠離子通道相關(guān)蛋白（FXYD5）基因真核表達(dá)載體,研究其對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（CRL-1444）的體外作用。方法以含F(xiàn)XYD5全長(zhǎng)cDNA的pBluescript II KS（+/-）載體為模板，并用PCR方法擴(kuò)增,將其連接于真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1（+），PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后，用脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染大鼠胸主動(dòng)脈細(xì)胞，轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)載體為實(shí)驗(yàn)組（PF組），轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒PCDNA3．1（+）為陰性對(duì)照組（NC組）和未做處理的為空白對(duì)照組（BC組）。Real-time PCR定量檢測(cè)各組FXYD5的表達(dá)水平，并研究該基因?qū)RL-1444細(xì)胞膜鈉鉀泵（Na+-K+-ATPase）活性、細(xì)胞增殖能力、遷移力的影響。結(jié)果重組的真核表達(dá)載體pcDNA3．1（+）-FXYD5構(gòu)建成功,PF組FXYD5的表達(dá)水平較BC組上調(diào)17．312倍（P＜0．05），PF組的細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性高于BC組和NC組（均P＜0．05），細(xì)胞增殖能力和遷移力均高于NC組（均P＜0．05）。結(jié)論成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3．1（+）-FXYD5，并在CRL-1444細(xì)胞中使FXYD5基因的表達(dá)水平增加，且增強(qiáng)CRL-1444細(xì)胞膜的Na+-K+-ATPase活性、細(xì)胞增殖和遷移能力。

真核表達(dá)載體；血管平滑肌細(xì)胞；鈉鉀泵

近年的研究結(jié)果表明，高血壓病是一種遺傳易患性加環(huán)境誘導(dǎo)共同作用下導(dǎo)致的，特別是家族多發(fā)性高血壓病患者具有很強(qiáng)的遺傳傾向[1]，并且該類患者較無(wú)高血壓家族史的血壓正常高值血管內(nèi)皮損傷更明顯[2]。FXYD蛋白家族最近被證明是一個(gè)組織特異性調(diào)節(jié)Na+-K+-ATPase的小跨膜蛋白[3]，近來(lái)Lubarski等[4]發(fā)現(xiàn)FXYD5和Na+-K+-ATPase的α1和β1亞單位共表達(dá)使鈉泵活性增加2倍。本實(shí)驗(yàn)前期研究通過(guò)基因芯片篩查，發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）組的該基因表達(dá)水平是Wistar大鼠（WKY）組的6.76%[5]。在高血壓的發(fā)病機(jī)制中，血管壁的平滑肌細(xì)胞起著重要的作用，為了進(jìn)一步明確FXYD5基因與高血壓形成、發(fā)展的關(guān)系，本研究構(gòu)建FXYD5真核表達(dá)載體，作用于大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，并對(duì)其功能進(jìn)行初步研究，為探討FXYD5在高血壓形成發(fā)展中所起的生物學(xué)作用奠定一定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株（CRL-1444）購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）。

1.2 主要試劑與儀器DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（高糖）、FBS平衡液、0.05%胰酶/EDTA、漢克（氏）平衡氯化鈉溶液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA萃取劑Trizol、LipofeetamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑、DEPC水（RNase-free and DNase-free）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RT試劑盒、DNase I（RNase-free 10 U/L）購(gòu)自加拿大Fermantas公司；高保真DNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自美國(guó)NEB公司，DH5α、PCDNA3.1（+）載體由本實(shí)驗(yàn)室保存,質(zhì)粒抽提試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Omega公司，Power SYBR?RGreen PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司，CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，超微量Na+-K+-ATPase測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。Backman DU800計(jì)算機(jī)分光光度分析儀購(gòu)自美國(guó)Backman公司；酶標(biāo)儀ELX800購(gòu)自美國(guó)百特公司。

1.3 方法

1.3.1 真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-FXYD5的構(gòu)建（1）引物設(shè)計(jì)與合成。正向引物（F）:5’CGG GAATTC AGACCTTGGGCTCGGACA（劃線部分依次是保護(hù)堿基，ECORⅠ酶切位點(diǎn)）；反向引物（R）:5’CGC TATCCA GAGGCAGGGGTGGTGAAC（劃線部分依次是保護(hù)堿基,ECORⅤ酶切位點(diǎn)）。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。（2）重組載體的構(gòu)建及鑒定。含F(xiàn)XYD5全長(zhǎng)cDNA的pBluescriptⅡKS（+/-）載體為模板，以“F、R”為引物、擴(kuò)增FXYD5編碼序列，PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體與PCR產(chǎn)物分別經(jīng)“ECORⅠ、ECORⅤ”雙酶切。T4連接酶連接酶切產(chǎn)物（4℃,16 h）后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在含有氨芐西林抗性LB平板上培養(yǎng)12～24h，挑取菌落，PCR鑒定陽(yáng)性克隆后擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，經(jīng)ECORⅠ、NOTⅠ雙酶切鑒定陽(yáng)性載體，最后經(jīng)測(cè)序分析確定構(gòu)建是否成功。測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.2 重組載體pcDNA3.1（+）-FXYD5在CRL-1444細(xì)胞中的表達(dá)CRL-1444細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM中。轉(zhuǎn)染前24h收集細(xì)胞，以1×105孔的密度接種于6孔板中。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)40%～60%融合度時(shí)，用Hanks清洗2次，400μl無(wú)血清DMEM中分別加入不同劑量質(zhì)粒和2.5μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，制成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物溶液。實(shí)驗(yàn)分BC組（未經(jīng)處理的空白對(duì)照組）、NC組[轉(zhuǎn)染pCDNA3.1（+）空質(zhì)粒1.0μg]、PF1～3組（重組質(zhì)粒0.5、1.0、1.5μg），共5組，轉(zhuǎn)染過(guò)程按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染6h后，換為含5%胎牛血清的DMEM，在37℃的5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集6孔板的細(xì)胞，提取總RNA檢測(cè)FXYD5的表達(dá)量。

1.3.3 半定量RT-PCR和Real-time PCR檢測(cè)FXYD5的mRNA表達(dá)水平轉(zhuǎn)染結(jié)束后常規(guī)提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以各組的cDNA為模板，引物仍為“F、R”，進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行GAPDH反應(yīng)，PCR體系和條件同前，凝膠成像系統(tǒng)下觀察目的條帶，結(jié)合轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染的特異性與細(xì)胞毒性，篩選出一個(gè)適宜的重組質(zhì)粒質(zhì)量（1.0μg），進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別對(duì)FXYD5和GAPDH進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，TRIZOL法常規(guī)提取總RNA，經(jīng)Dase I消化去除基因組DNA污染，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第1鏈，以cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：2× SYBR Green PCR Master mix 7.5μl，100ng/μl的cDNA 1μl，10μM/L的上下游引物各0.5μl，滅菌去離子水5.5μl；PCR擴(kuò)增條件：50℃2min→95℃10 min→（92℃15s→60℃1min）×40cycles,之后作融解曲線，確定產(chǎn)物單一性。引物序列：5’-CCTAGTGAAGGGCAGACACCAG-3’（FXYD5forward），5’-TGGCCATTTCGGTCAGTTG-3’（FXYD5reverse），5’-GTCATCATCTCCGCCCCTT-3’（GAPDHforward），5’-TTCTGAGTGGCAGTGATGGC-3’（GAPDHreverse）。所有樣品均重復(fù)檢測(cè)3次，并用ABI公司的附帶專門(mén)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,通過(guò)比較ΔCt的方法進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析[6]。

1.3.4 Na+-K+-ATPase活性檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染48h后的3組細(xì)胞，制成106～107/ml細(xì)胞懸液，超聲破碎細(xì)胞（2s/次，間歇8s，反復(fù)5次），用BCA法定量蛋白濃度。嚴(yán)格按照超微量ATP酶測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶促反應(yīng)后定磷，測(cè)各組吸光度值A(chǔ)636，由公式得到各組Na+-K+-ATPase活性（U/mg）。

1.3.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖接種CRL-1444細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板（細(xì)胞密度約2.5×103/ml），培養(yǎng)24h后分3組（BC組、NC組、PF組），后兩組每孔予0.05μg質(zhì)粒和0.25μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染，另設(shè)一組空白孔（只含培養(yǎng)液），48h后加入10μl/孔CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)40min后用酶標(biāo)儀測(cè)定各組吸光度值A(chǔ)450。

1.3.6 劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移力轉(zhuǎn)染24h后，經(jīng)無(wú)血清DMEM同步化24h，用無(wú)菌的移液管尖（約0.5mm）在各培養(yǎng)板細(xì)胞生長(zhǎng)單層的相同位置劃平行線，PBS洗3次，進(jìn)行第1次定位拍照。加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，孵箱培養(yǎng)24h，再次進(jìn)行PBS洗細(xì)胞3次，隨機(jī)選取10個(gè)視野再次進(jìn)行相同位置的拍照（×40），軟件（Image-Pro Plus，v6.0）測(cè)量遷移距離最遠(yuǎn)的細(xì)胞至起始處的距離及遷移進(jìn)劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料經(jīng)過(guò)方差齊性檢驗(yàn)，以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，獨(dú)立的兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1（+）-FXYD5真核表達(dá)載體初步鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離得到1條約600 bp的特異性條帶（圖1A）,與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小相符。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收，連接的目的基因載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后，在細(xì)菌平板上隨機(jī)挑取10個(gè)克隆，經(jīng)菌落PCR快速鑒定，4個(gè)克?。?、7、8、9號(hào)）在600～700bp有明顯陽(yáng)性條帶(圖1B)。

2.2 pcDNA3.1（+）-FXYD5真核表達(dá)載體的酶切鑒定及測(cè)序分析將4個(gè)陽(yáng)性單克隆擴(kuò)增菌液后提質(zhì)粒，EcorI、NotI雙酶切，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示有大小兩個(gè)片段，小片段的跑膠位置與FXYD5的PCR產(chǎn)物大小相近，大片段與空載體雙酶切片段的位置一致（圖2），將鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒送公司進(jìn)行測(cè)序（圖3），經(jīng)BLAST比對(duì)符合設(shè)計(jì)要求，成功構(gòu)建了pcDNA3.1（+）-FXYD5真核表達(dá)載體。

圖1 FXYD5基因的擴(kuò)增和初步鑒定。A.1為DNA marker，2、3、4為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B.菌落PCR鑒定，4、7、8、9為陽(yáng)性克隆。

圖2 pcDNA3.1（+）-FXYD5的雙酶切鑒定。1.重組載體pcDNA3.1（+）-FXYD5雙酶切，2.pcDNA3.1（+）質(zhì)粒雙酶切，3.重組載體pcDNA3.1（+）-FXYD5，4.pcDNA3.1（+）質(zhì)粒，5.DNAmarker。

2.3 FXYD5的mRNA表達(dá)水平半定量RT-PCR初步篩選的結(jié)果見(jiàn)圖4，Real-time PCR進(jìn)一步檢測(cè)示PF組FXYD5表達(dá)量為17.312±2.666，較BC組1.000和NC組1.282±0.168增加（均P＜0.05），而NC組與BC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 重組載體pcDNA3.1（+）-FXYD5轉(zhuǎn)染對(duì)CRL-1444細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性的影響PF組細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性為3.190±0.148，較BC組 2.093±0.774和NC組2.465±0.260降低（均P＜0.05），而NC組與BC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 重組載體pcDNA3.1（+）-FXYD5轉(zhuǎn)染對(duì)CRL-1444細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組相比，PF組細(xì)胞增殖活性A450為1.183±0.094，較NC組0.975±0.033高（P＜0.05），但較BC組1.390±0.082低（P＜0.05）。

2.6 重組載體pcDNA3.1（+）-FXYD5轉(zhuǎn)染對(duì)CRL-1444細(xì)胞遷移能力的影響與對(duì)照組相比，PF組平滑肌細(xì)胞遷移距離為（276.423±6.167）μm，較NC組（247.153±6.740）μm遠(yuǎn)（P＜0.05），但與BC組（283.180±6.703）μm相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 重組載體pcDNA3.1（+）-FXYD5測(cè)序結(jié)果。

圖4 FXYD5的mRNA水平半定量RT-PCR結(jié)果。1.BC組，2.NC組，3～5.PF1～3組。

3 討論

本研究是應(yīng)用構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）來(lái)研究FXYD5基因的功能。為了獲得預(yù)期的重組載體，我們采用雙酶切法消化FXYD5的PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1（+），能夠使目的基因與載體定向連接。經(jīng)測(cè)序和雙酶切鑒定，本實(shí)驗(yàn)的真核表達(dá)載體pcD NA3.1（+）-FXYD5構(gòu)建成功。成功轉(zhuǎn)染CRL-1444細(xì)胞，經(jīng)半定量PCR，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞，提高了FXYD5的表達(dá)水平，獲得了預(yù)期效果。

FXYD家族是單跨膜蛋白，其蛋白家族成員作為組織特異性Na+-K+-ATPase的調(diào)節(jié)因子，據(jù)其細(xì)胞外基序FXYD的不同分為7個(gè)。FXYD5（又名dysadherin）是FXYD家族里單跨膜的Ⅰ型膜蛋白，但其結(jié)構(gòu)與家族里其他成員不同，F(xiàn)XYD5胞外段＞140個(gè)氨基酸，而胞內(nèi)段僅含15個(gè)氨基酸[7-8]，其他成員胞外段＜40個(gè)氨基酸。Lubarski等[4]發(fā)現(xiàn)FXYD5與Na+-K+-ATPase之間有明顯的親和力并且可以提高Na+-K+-ATPase的活性，其與Na+-K+-ATPase α1和β1亞單位共表達(dá)使鈉泵活性增加2倍。

本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)通過(guò)基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)水平SHR組為WKY組的6.76%[5]，提示其在高血壓的發(fā)生發(fā)展中可能起到一定作用。但是對(duì)于FXYD5在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起著何種作用暫無(wú)明確的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CRL-1444細(xì)胞，人為地提高FXYD5基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該基因的高表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性。Na+-K+-ATPase在機(jī)體內(nèi)起著重要的作用，國(guó)外研究已發(fā)現(xiàn)鈉泵功能的異常與高血壓密切相關(guān)，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)Na+-K+-ATPase上確實(shí)存在調(diào)節(jié)血壓的位點(diǎn)，并與人和鼠的高血壓密切相關(guān)[9-10]。Na+-K+-ATPase活性的下降會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+濃度的增高，細(xì)胞水腫，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞而言，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈管腔狹窄；其次細(xì)胞內(nèi)Na+高濃度會(huì)導(dǎo)致Na+-Ca2+交換增加，平滑肌細(xì)胞Ca2+內(nèi)流增加，外流減少，這種Na+、Ca2+水平的改變會(huì)直接影響平滑肌細(xì)胞興奮性，使血管緊張性增高，外周血管阻力增加，引起血壓升高。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)提高FXYD5的表達(dá)水平，與陰性對(duì)照組相比可以增強(qiáng)CRL-1444細(xì)胞增殖活性，這可能與FXYD5影響Na+-K+-ATPase活性后引起的細(xì)胞生理行為（如細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)離子濃度的變化，以及與其他的細(xì)胞信號(hào)蛋白活化）的改變相關(guān)，國(guó)外研究已證實(shí)，Na+-K+-ATPase的異?？梢鸺?xì)胞增殖、凋亡和混合性死亡[11-12]。本實(shí)驗(yàn)的另一結(jié)果發(fā)現(xiàn)FXYD5的過(guò)表達(dá)能使其遷移能力增強(qiáng)，這可能與該基因所體現(xiàn)的抗黏附作用相關(guān)，與Ino等[13]在腫瘤細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。此外，我們發(fā)現(xiàn)PF組細(xì)胞的增殖、遷移能力并不強(qiáng)于BC組，這可能是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與外源性重組質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞有一定毒副作用，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，但是與同樣轉(zhuǎn)染條件的NC組相比，PF組在增殖、遷移上還是具有優(yōu)勢(shì)的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了FXYD5真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染CRL-1444細(xì)胞，對(duì)其細(xì)胞功能做了初步研究，證明了FXYD5很有可能是高血壓病新的致病基因之一，為今后進(jìn)一步探索FXYD5基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of eukaryotic expression vector of rat FXYD5 gene and preliminary study of its function

WANG Benji,PAN Jialin,HUANG Xiaoyan,et al.
Department of Intensive Care Unit,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000,China

YANG Deye,E-mail:deyeyang@126.com

Objective To construct eukaryotic expression vector of pcDNA3．1(+)-FXYD5 gene and explore its effect on rat vascular smooth muscle cells(CRL-1444)．Methods The pBluescript II KS(+/-)vector which contained full-length FXYD5 cDNA was amplified by PCR,and cloned into pcDNA3．1(+)plasmid．The recombinant plasmid was verified by PCR,double enzyme digestion analysis and DNA sequencing．CRL-1444 cells were transfected with pcDNA3．1(+) -FXYD5 using Lipofectamin 2000 as experimental group(PF),transfected with PCDNA3．1(+)as negative control group(NC) and not transfected as blank control group(BC)．The expression of FXYD5 was measured quantitatively by real-time PCR．The effects of the gene on membrane Na+-K+-ATPase activity,proliferation and migration of CRL-1444 cells were investigated．Results The FXYD5 gene was successfully cloned into pcDNA3．1(+)．In comparison with BC group,the expression of FXYD5 in PF group was increased by 17．312(P＜0．05)．The membrane Na+-K+-ATPase activity was significantly higher in PF group than in BC group and NC group(P＜0．05)．The ability of cell proliferation and migration was significantly higher in PF group than in NC group(P＜0．05)．Conclusion The eukaryotic expression vector pcDNA3．1(+)-FXYD5 is successfully constructed and FXYD5 expression increases in CRL-1444 cells,which enhance the cell membrane Na+-K+-ATPase activity,cell proliferation and migration ability．

Eukaryotic expression vector;Vascular smooth muscle cells;Na+-K+-ATPase

2013-04-07）

（本文編輯：馬雯娜）

衛(wèi)生部科學(xué)研究基金（wkj-2008-2-031）

325000溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院ICU,溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科（黃曉燕、施翔翔）,杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科（楊德業(yè)）

楊德業(yè)，E-mail:deyeyang@126.com