楊 銳 王芬珍

在體大鼠心肌缺血再灌注損傷中NF-κBp65與AngⅡ表達(dá)的變化

楊 銳 王芬珍

目的觀察在體大鼠心肌缺血的不同再灌注時(shí)程N(yùn)F-κBp65與AngⅡ表達(dá)的變化。方法40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為R15min組、R30min組、R60min組、R120min組及對(duì)照組。經(jīng)缺血30min及不同時(shí)間的再灌注（15，30，60，120 min）而建立在體心肌缺血再灌注損傷模型。以ELISA法定量檢測(cè)NF-κBp65蛋白的DNA結(jié)合活性；采用放射免疫分析法檢測(cè)血漿及心肌組織AngⅡ含量。通過Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)對(duì)NF-κBp65與循環(huán)及心肌局部的AngⅡ含量做相關(guān)性分析。結(jié)果NF-κBp65蛋白表達(dá)量隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，于R60min時(shí)達(dá)高峰，R120min組與R60min組比有所下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但仍高于R30min組；各實(shí)驗(yàn)組血漿及心肌局部AngⅡ含量與對(duì)照組比明顯升高，隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩者呈直線正相關(guān)（r=0.859、0.809，均P＜0.05）。結(jié)論心肌缺血再灌注損傷時(shí)NF-κBp65及血液與心肌AngⅡ均增高。

缺血再灌注損傷；核因子-κB；血管緊張素Ⅱ

20世紀(jì)80年代以來，隨著心臟介入治療學(xué)的推廣應(yīng)用，心肌缺血再灌注損傷（IRI）的現(xiàn)象日益引起學(xué)者們的關(guān)注。核因子-κB（NF-κB）是一類與多種基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)總稱，其為一個(gè)氧化還原敏感的可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控,在機(jī)體多種生物活性物質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年的研究表明，NF-κB亦參與心肌缺血再灌注所致的心肌炎性反應(yīng)、凋亡、壞死、心功能下降等病程的發(fā)生發(fā)展[1]。因此，NF-κB與心肌IRI的關(guān)系備受關(guān)注。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS），尤其是心臟RAS的發(fā)現(xiàn)，是近10余年來RAS研究的重大進(jìn)展，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為RAS的主要活性肽，參與心肌IRI發(fā)生發(fā)展。為此，本研究觀察在體大鼠心肌缺血再灌注不同時(shí)程N(yùn)F-κBp65蛋白與AngⅡ表達(dá)的變化，初步探討它們?cè)诖瞬±砩磉^程中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器（1）NO.78833核蛋白提取試劑盒由德國(guó)Pierce公司提供；ELISA試劑盒（Catalog Nos 40096）由美國(guó)Active Motif公司提供；標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Catalog Nos 31102）由美國(guó)Active Motif公司提供；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；AngⅡ放射免疫分析藥盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供；兔抗NF-κBp65多克隆抗體[SC-109（A）]由美國(guó)Santa Cruz公司提供；羊抗兔MaxVisionTM二抗試劑盒（一步法）由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供；DAB顯色試劑盒由北京中山生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。（2）SN-682B-3型放射免疫γ-計(jì)數(shù)器由中國(guó)安徽中科公司提供；小動(dòng)物呼吸機(jī)（TKR-200C）由江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司提供；CX21光學(xué)顯微鏡BX-41顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)由日本OLYMPUS公司提供；UV-2501PC紫外分光光度計(jì)由日本島津公司提供；5810R高速低溫離心機(jī)由德國(guó)Eppendorf Centrifuge公司提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組和模型的制作雄性健康清潔型SD大鼠40只，體重250～300g，由福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：（1）缺血30min再灌注15min（R15min組）；（2）缺血30min再灌注30min（R30min組）；（3）缺血30 min再灌注60 min（R60min組）；（4）缺血30min再灌注120min（R120min組）；（5）對(duì)照組。參照文獻(xiàn)[2]改進(jìn)建立動(dòng)物模型：大鼠經(jīng)10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉仰臥位固定，頸部去毛，作正中縱向切口約1cm長(zhǎng)，鈍性分離皮下喉部肌肉，暴露氣管，插入大小適宜的氣管套管。剪去胸前手術(shù)區(qū)毛，左胸（正中線旁約0.5cm）作2cm長(zhǎng)的縱向切口，鈍性分離胸大肌，暴露肋骨，呼吸機(jī)與氣管插管連接，設(shè)置潮氣量1.5ml/100g，頻率60次/min。分離第四肋間肌，剪開心包，充分暴露心臟（主要是心底部），使左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間的心大靜脈清晰可見（左冠狀動(dòng)脈主干在此與之并行），以此靜脈為標(biāo)志，在左心耳下方2mm處用6/0 Prolene線穿過，進(jìn)針深度為1～1.5mm，寬2～3mm，橫跨心大靜脈備用。實(shí)驗(yàn)組將絲線兩端穿入一管徑2mm的聚乙烯管，推管壓迫心肌使冠狀動(dòng)脈左前降支造成左心室前壁心肌缺血30min，然后松開線，分別再灌注15min、30min、60min、120min，對(duì)照組僅穿線但不收緊線。實(shí)驗(yàn)開始同時(shí)將針形電極插入四肢皮下監(jiān)測(cè)Ⅱ心電圖，ST段抬高0.2mV標(biāo)志心肌缺血，以ST段驟降1/2以上標(biāo)志再灌注成功。其中實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)心室顫動(dòng)、出血過多及未到觀察總時(shí)間死亡者棄之不用，直至達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)數(shù)。

1.2.2 標(biāo)本的采集與處理于實(shí)驗(yàn)結(jié)束相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。（1）取血：迅速開腹，下腔靜脈穿刺取血2ml，加入含蛋白酶抑制劑的真空試管用于血漿AngⅡ含量的檢測(cè)。（2）取組織：迅速剪取平行房室溝下2mm處的心室肌，取左心室游離壁為缺血區(qū)心肌，分成2小塊，一塊迅速置入凍存管，液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于核蛋白的提?。涣硪粔K新鮮組織用于檢測(cè)組織AngⅡ含量。按試劑盒說明書處理樣本,采用均相競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法直接測(cè)定血漿和心肌中的AngⅡ含量。

1.2.3 心肌組織NF-κBp65蛋白核易位及轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)用NF-κBp65蛋白的特異性抗體對(duì)心肌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，以PBS代替第一抗體做陰性對(duì)照組；進(jìn)一步提取大鼠心肌組織細(xì)胞核蛋白，按照考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒說明書，定量細(xì)胞核蛋白數(shù)量，按TransAM NF-κBp65蛋白活性檢測(cè)試劑盒說明書，采用ELISA法檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)血漿及心肌組織AngⅡ含量的變化；心肌組織NF-κBp65蛋白核易位變化及蛋白轉(zhuǎn)錄活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 各組光鏡下組織形態(tài)變化各實(shí)驗(yàn)組大鼠隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)行性出現(xiàn)心肌纖維大片狀壞死，界線不清，胞漿淡染，核濃縮或核溶解，部分心肌纖維扭曲、腫脹、斷裂，伴有大量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A～D）；而對(duì)照組大鼠左心室心肌纖維排列呈束狀，結(jié)構(gòu)清楚，心肌間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯組織學(xué)改變（圖1E）。

2.2 各組NF-κBp65蛋白核易位變化及蛋白轉(zhuǎn)錄活性比較見表1、圖2。

由表1、圖2可見，IRI誘發(fā)后15min即可見胞漿表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)活化的NF-κBp65蛋白發(fā)生核易位，且其表達(dá)量呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性，于R60min時(shí)達(dá)高峰，R120min時(shí)又有所降低，但仍高于R30min組，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），陰性對(duì)照組未見陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組在心肌細(xì)胞胞漿中少量表達(dá)，偶見核易位；進(jìn)一步檢測(cè)NF-κBp65蛋白活性發(fā)現(xiàn)IRI后NF-κBp65蛋白被迅速激活，與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組NF-κBp65蛋白活性顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。IRI后NF-κBp65蛋白于R60min時(shí)達(dá)高峰，而后活性有所降低，但R120min時(shí)仍高于R30min，各IRI組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 各組血漿及心肌組織AngⅡ含量比較見表2。

圖1 各組心肌組織HE染色（×400）。A.R15min組；B.R30min組；C.R60min組；D.R120min組；E.對(duì)照組。

表1 各組NF-κBp65蛋白核易位變化及蛋白轉(zhuǎn)錄活性比較

圖2 免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定各組NF-κBp65核易位變化（×400）。A.R15min組；B.R30min組；C.R60min組；D.R120min組；E.陰性對(duì)照組；F.對(duì)照組。

表2 各組血漿及組織AngⅡ含量比較

由表2可見，各實(shí)驗(yàn)組血漿AngⅡ含量與對(duì)照組比較均升高（P＜0.05），且隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)，但R15min組與R30min組、R60min組與R120min組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組組織AngⅡ含量明顯升高（均P＜0.05），組織AngⅡ含量隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，R15min組與R30min組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 NF-κBp65活性與AngⅡ表達(dá)的相關(guān)性分析見圖3、4。

由圖3、4可見，隨著NF-κBp65活性的增強(qiáng)，血漿及心肌組織AngⅡ含量呈上升趨勢(shì)，NF-κBp65活性與血漿及組織AngⅡ含量均呈直線正相關(guān)（r=0.859、0.809，均P＜0.05）。

圖3 NF-κBp65活性與血漿AngⅡ含量關(guān)系

圖4 NF-κBp65活性與組織AngⅡ含量關(guān)系

3 討論

急性缺血性心臟病的基礎(chǔ)性治療是早期再灌注以恢復(fù)心肌代謝平衡，但事實(shí)上缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)血液供應(yīng)后可能轉(zhuǎn)化為不可逆損傷，稱為心肌IRI[3]。這種損傷是由多種觸發(fā)物、媒介物效應(yīng)器參與的復(fù)雜生物反應(yīng)過程，涉及多種復(fù)雜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，并在多層次和諸多環(huán)節(jié)存在交互作用[4]。其中NF-κB、RAS等信號(hào)系統(tǒng)在IRI中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[5]。

NF-κB是一個(gè)氧化還原敏感的可誘導(dǎo)的前炎性轉(zhuǎn)錄因子，幾乎存在于所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，由多亞單位組成，其中最常見的激活形式是p50或p52/ p65異源二聚體。現(xiàn)已明確，NF-κB參與機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控，在機(jī)體多種生物活性物質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。缺血再灌注激活NF-κB，在轉(zhuǎn)錄水平NF-κB調(diào)控的物質(zhì)均能直接或間接地參與心肌IRI，從而對(duì)心肌功能產(chǎn)生很大的負(fù)性效應(yīng)，而這些因子反過來又能激活NF-κB，從而形成正反饋，進(jìn)一步擴(kuò)大局部炎癥反應(yīng)[6]，同時(shí)NF-κB還通過與其它轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用，在轉(zhuǎn)錄水平上形成復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[7]。本研究通過ELISA法對(duì)NF-κBp65蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)錄后的DNA結(jié)合活性準(zhǔn)確定量，結(jié)果顯示心肌IRI后NF-κBp65蛋白被迅速激活，與對(duì)照組比較各實(shí)驗(yàn)組NF-κB p65蛋白的DNA結(jié)合活性顯著升高，于R60min時(shí)達(dá)高峰，R120min時(shí)又有所下降，但仍高于R30min時(shí)，可能歸咎于抑制型-κB（IκB）的降解和（或）NF-κB激活的促炎因子的反向激活，NF-κB參與基因轉(zhuǎn)錄后，細(xì)胞內(nèi)IκBα的合成隨之啟動(dòng)，新合成的IκB使與DNA結(jié)合的NF-κB二聚體失活，NF-κB返回到細(xì)胞質(zhì)重新利用[8]。可以看出NF-κBp65激活與心肌IRI密切相關(guān)，在此病理過程中，NF-κB激活是炎性介質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的“扳機(jī)事件”，因此研究其表達(dá)變化規(guī)律可能會(huì)找到防治心肌IRI合適的調(diào)節(jié)點(diǎn)。

組織RAS，尤其是心臟RAS的發(fā)現(xiàn),是近10余年來RAS研究的重大進(jìn)展[9]。心臟的RAS獨(dú)立而完整,它包括腎素（RE）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、AngⅠ、AngⅡ及其受體（AT1R和AT2R）等，其中AngⅡ是主要活性成份。心臟局部的RAS通過自分泌、旁分泌及細(xì)胞內(nèi)分泌等方式對(duì)心肌細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用，以保證正常的功能狀態(tài)，其功能有收縮冠狀動(dòng)脈、增加心肌收縮力、刺激心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及缺血再灌注過程中影響心肌代謝和電活動(dòng)穩(wěn)定性等。但同時(shí)它在急性心肌缺血的發(fā)生發(fā)展及病情演變中扮演著重要的角色。近年研究發(fā)現(xiàn)，心肌IRI時(shí)心肌組織RAS被激活,使局部的RE、AngⅠ、AngⅡ含量均增加，AngⅡ?qū)θ毖募【哂斜姸嗟牟焕绊慬10]，如：能量耗竭；細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載；損傷內(nèi)皮功能等，并與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11]，AngⅡ還有致炎作用[12]。我們觀察血漿及心肌組織AngⅡ含量的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較各實(shí)驗(yàn)組血漿AngⅡ含量明顯升高，隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)有升高趨勢(shì)，后期變化不明顯，提示IRI早期可迅速誘導(dǎo)循環(huán)RAS激活，以提供短期支持效果；而缺血區(qū)心肌AngⅡ含量隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，變化顯著，提示心肌局部RAS在IRI早期即被激活并隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)發(fā)揮作用。因此，我們認(rèn)為在心肌IRI的病理過程中，循環(huán)及局部RAS均被迅速激活，而且可能是心肌局部的RAS發(fā)揮更強(qiáng)大而持久的作用。

通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)NF-κBp65與血漿及心肌組織的AngⅡ含量均具有顯著的直線正相關(guān)，已有多項(xiàng)研究顯示兩者IRI中相互調(diào)節(jié)、相互促進(jìn)、相互影響，利用其表達(dá)變化規(guī)律可能找到合適的防治心肌IRI調(diào)節(jié)點(diǎn)后續(xù)，我們將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討。

[1]Valen G.Signal transduction through nuclear factor kappa B in ischemia-reperfusion and heart failure[J].Basic Res Cardiol，2004，99（1）∶1-7.

[2]劉付平，姚宏偉，李俊.大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的改進(jìn)[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2003，38（3）∶234-236.

[3]Zhan Z Q，Zang Y M．Alternative cardioprotective strategy during reperfu-sion∶posteonditioning vs preconditiomng[J].Chinese Heart Journal，2010，l8（1）∶1-7,13．

[4]黃文林，朱孝峰.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[M].北京∶人民衛(wèi)生出版社，2005∶1.

[5]馮睿章，黨萬太.心肌缺血/再灌注損傷與細(xì)胞內(nèi)多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展[J].四川生理科學(xué)雜志，2012，34（1）∶32-34.

[6]Hiasa G,Hamada M，Ikeda S,et al.Ischemic preconditioning and lipopolysaccharide attenuate nuclear factor-kappaB activation and gene expression of inflammatory cytokines in the ischemia-reperfused rat heart[J].Jpn Circ J，2001，65（11）∶984-990.

[7]Haiying F,Baogui S,Qiuping G,et al.Oxygen radicals trigger activation of NF-kB and AP-1 and upregulation of ICAM-1 in reperfused canine heart[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，282（5）∶1778-1786.

[8]Li C,Kao R L，Ha T，et al.Early activation of IKKbeta during in vivo myocardial ischemia[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280（3）∶1264-1271.

[9]Sanghi S,Kumar R,Smith M,et al.Activation ofprotein kinase a by atrial natriuretic peptide in neonatal rat cardiac fibroblast∶role in regulation of the local rennin-Angiotensin system[J].RegulPept，2005，132（1-3）∶1-8.

[10]曾曉聰，李醒三.AT1受體阻滯劑在心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（11）∶1717-1719.

[11]林濤，王艷紅，張英霞.冠心病患者血漿腎素-血管緊張素Ⅱ-醛固酮活性變化及臨床意義[J].中華高血壓雜志，2006，14（8）∶660-661.

[12]Ishiyama Y,Gallagher P E,Averill D B,et al.Upregulation of angiotensin-converting enzyme2 after myocardial infarction by blockade of angioten-sinòreceptors[J].Hypertension，2004，43∶970-976.

The changes of NF-κB p65 and Angll during myocardial ischemia-reperfusion injury in rats

YANG Rui，WANG Fenzhen.
Department of Cardiology，the Ningbo NO.1 Hospital.Ningbo 315000,China
Corresponing author:YANG Rui，E-mail：youngrui@hotmail.com

ObjectiveTo observe the changes of NF-κB p65 and AngⅡduring various periods of myocardial ischemia-reperfusion.Methods40 rats were randomly divided into R15min,R30min,R60minand R120mingroups and control group.Rat model of myocardial ischemia-reperfusion was established based on 30-min ischemia followed by reperfusion for various periods(15,30,60,120min).The DNA-binding activity of NF-κB p65 was detected quantitatively by ELISA. AngⅡin blood plasma and myocardium were measured by radioimmunoassay.The relevance of NF-κB p65 to AngⅡin blood plasma and myocardium was analyzed by Pearson correlation test.ResultsThe expression of NF-κB p65 had a tendency toward increase in parallel to the prolongation of reperfusion,with the highest in group R60min,followed by group R120minand group R30min.There was significantly different between any two groups(P＜0.05).AngⅡin blood plasma and myocardium was significantly higher in each ischemia-reperfusion group than in control group,which gradually increased with the prolongation of reperfusion(P＜0.05).There was a positive linear correlation between NF-κB p65 and Ang II in blood plasma and myocardium(r=0.859、0.809,P＜0.05).ConclusionNF-κB p65 as well as AngII in blood plasma and myocardium increase during myocardial ischemia-reperfusion injury.

Ischemia-reperfusion injury;Nuclear factor-kappa B;AngiotensinⅡ

2013-08-28）

（本文編輯：楊麗）

315000浙江省寧波市第一醫(yī)院心內(nèi)科

楊銳，E-mail：youngrui@hotmail.com