張振輝， 黎 佼， 熊旭明， 陳偉燕， 劉世明△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2心血管內(nèi)科，廣州心血管疾病研究所，廣東廣州 510260)

微小RNA-199a-5p調(diào)控大鼠心肌細(xì)胞肥大的研究*

張振輝1， 黎 佼2， 熊旭明1， 陳偉燕1， 劉世明2△

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2心血管內(nèi)科，廣州心血管疾病研究所，廣東廣州 510260)

目的：探討微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)在心肌肥大模型中的表達(dá)及對大鼠心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用。方法：用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)(TAAC)構(gòu)建心肌肥大大鼠模型，體外培養(yǎng)新生Sprague-Dawley大鼠心肌細(xì)胞，用血管緊張素II(Ang II)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測動(dòng)物血漿和心肌細(xì)胞miR-199a-5p含量;合成大鼠miR-199a-5p的擬似物(mimic)和抑制劑(inhibitor)，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mimic和inhibitor進(jìn)入心肌細(xì)胞，用qRT-PCR檢測肥大基因心房鈉尿因子和β-肌球蛋白重鏈mRNA的表達(dá)變化;用氚標(biāo)亮氨酸摻入量檢測細(xì)胞蛋白合成速率變化;用細(xì)胞熒光染色法檢測細(xì)胞表面積變化。結(jié)果：TAAC術(shù)后28 d，大鼠血漿miR-199a-5p的含量較對照組顯著增加(P＜0.05)，在Ang II誘導(dǎo)肥大的心肌細(xì)胞中，miR-199a-5p的表達(dá)量也較對照組顯著增加。在心肌細(xì)胞中過表達(dá)miR-199a-5p，能使細(xì)胞肥大基因表達(dá)增加，蛋白合成速率加快，細(xì)胞表面積增大，而使用inhibitor阻遏miR-199a-5p的作用后，能抑制Ang II誘導(dǎo)的肥大基因表達(dá)、細(xì)胞蛋白合成速率和細(xì)胞表面積的變化。結(jié)論：心肌肥大動(dòng)物和細(xì)胞模型中miR-199a-5p的表達(dá)發(fā)生上調(diào)。過表達(dá)miR-199a-5p能促進(jìn)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大，而阻遏miR-199a-5p的作用能抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

微小RNA;心肌肥大;血管緊張素II

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約19～25 nt的單鏈非編碼RNA分子。miRNAs通過調(diào)控基因表達(dá)來參與生命過程中的一系列重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育，細(xì)胞增殖、凋亡和分化等［1-3］。近年的研究發(fā)現(xiàn)，心肌肥大/心力衰竭等多種心臟疾病的發(fā)病受miRNA的調(diào)控［4-6］。本研究組通過腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)(transverse abdominal aortic constriction，TAAC)建立壓力過負(fù)荷性心肌肥大模型，發(fā)現(xiàn)心肌肥大大鼠血漿中的microRNA-199a-5p(miR-199a-5p)升高明顯。目前關(guān)于miR-199a-5p對心肌肥大的調(diào)控作用仍缺乏報(bào)道。本研究通過體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)或抑制miR-199a-5p，觀察其對心肌細(xì)胞肥大的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料和方法

1 材料

1.1 試劑和儀器 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、Opti-MEM細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶購自Gibco;細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX、RNA抽提裂解液Trizol和SYBR Green qPCR熒光定量PCR試劑盒均購自 Invitrogen;5-溴脫氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)購自Sigma。［3H］-亮氨酸、閃爍液和閃爍瓶購自Perkin Elmer。液體閃爍計(jì)數(shù)器(Tri-Carb 2900TR)，熒光定量PCR儀(ABI7500)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(sham組)和手術(shù)組(TAAC組)。將細(xì)胞分為對照(control，Con)組、AngⅡ組、miR-199a-5p擬似物的陰性對照(negative control，NC)組、miR-199a-5p擬似物轉(zhuǎn)染組(miR-199a-5p組)、miR-199a-5p抑制劑陰性對照(inhibitor negative control，INC)組、INC+AngⅡ組(先轉(zhuǎn)染INC，再加AngⅡ作用)和anti-miR-199a-5p +AngⅡ組 (先轉(zhuǎn)染miR-199a-5p的inhibitor，再加AngⅡ作用)。

2 方法

2.1 Wistar大鼠心肌肥大動(dòng)物模型的制備 采用TAAC方法建立壓力過負(fù)荷心肌肥大大鼠模型。SPF級(jí)Wistar大鼠16只(購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重(100±10)g，隨機(jī)分為sham組(n=8)和TAAC組(n=8)。造模前8 h禁食不禁水。3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)腹腔注射，麻醉固定后，常規(guī)消毒，腹部正中切口，打開腹腔，逐層分離，于左腎動(dòng)脈上方分離腹主動(dòng)脈，在左腎動(dòng)脈以上0.5 cm處，用4.0絲線繞穿該處腹主動(dòng)脈，將預(yù)先彎曲好的5號(hào)針頭(外徑0.5 mm)置于擬縮窄處的腹主動(dòng)脈旁，絲線將其與腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎，之后將針頭抽出，造成腹主動(dòng)脈部分縮窄，假手術(shù)組僅分離出腹主動(dòng)脈而不行縮窄術(shù)。至第28天心臟采血收集動(dòng)物血標(biāo)本，模型制備和驗(yàn)證參考文獻(xiàn)報(bào)道［7］。

2.2 原代心室肌細(xì)胞(cardiomyocytes，CM)的分離、培養(yǎng) 新生1～2 d Sprague-Dawley大鼠(購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)常規(guī)乙醇消毒，剪開胸腔，超凈工作臺(tái)中無菌條件下取心尖部，將心室組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎片后用0.25%胰蛋白酶37℃水浴分次消化。采用差速貼壁原理分離CM，調(diào)整細(xì)胞密度為3×108/L，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。前48 h加BrdU 0.1 mmol/L。培養(yǎng)至第4天后去血清培養(yǎng)過夜，第5天的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)［8］。

2.3 寡核苷酸序列設(shè)計(jì)與合成 大鼠miR-199a-5p的擬似物(mimic)根據(jù)其成熟體序列(miRBase accession No.MIMAT0000872)合成，為雙鏈結(jié)構(gòu);miR-199a-5p的抑制劑(inhibitor)則采用miR-199a-5p成熟體的反向互補(bǔ)序列，并對所有堿基都進(jìn)行2’-甲氧基修飾(由吉瑪公司設(shè)計(jì))，為單鏈結(jié)構(gòu)。雙鏈RNA的陰性對照(NC)和單鏈RNA的陰性對照(INC)為非哺乳動(dòng)物基因組的同源性序列，由吉瑪公司設(shè)計(jì)和合成。PCR引物由上海英駿生物公司合成，見表1。

2.4 AngⅡ誘導(dǎo)乳鼠原代CM肥大 按照方法2.2分離培養(yǎng)CM，加入1 μmol/L AngⅡ培養(yǎng)的CM(等量超純水作為對照)，無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞檢測。

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miRNA的轉(zhuǎn)染使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX，按說明書操作，miRNA終濃度為100 nmol/L。最后一次轉(zhuǎn)染的48 h或72 h后按實(shí)驗(yàn)需要處理細(xì)胞。

2.6 大鼠血漿樣本和CM總RNA的提取及qRTPCR檢測 動(dòng)物血漿樣本經(jīng)方法2.1步驟分離獲得后，每份取330 μL，加入670 μL Trizol試劑，用氯仿、異丙醇、75%乙醇分離、沉淀、清洗RNA，質(zhì)檢、定量。按Trizol試劑盒說明書的操作步驟提取培養(yǎng)的貼壁CM的總RNA;按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(16℃ 30 min，42℃ 40 min，85℃ 5 min)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR過程按qPCR試劑盒說明書在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件:95℃ 3 min;45個(gè)PCR循環(huán)(95℃15 s，60℃20 s，72℃20 s，78℃20 s)。miRNA使用U6作為內(nèi)參照，mRNA使用18S作為內(nèi)參照同時(shí)進(jìn)行PCR，獲得Ct值后，應(yīng)用比較Ct法進(jìn)行相對定量，目標(biāo)基因的相對定量按2-ΔΔCt計(jì)算。

2.7 氚標(biāo)亮氨酸摻入法(［3H］-Leu incorporation)檢測CM蛋白合成速率 CM培養(yǎng)于24孔板中，培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染條件同上，收集前12 h每孔加入氚標(biāo)亮氨酸3.7×104Bq，收集細(xì)胞時(shí)先去掉培養(yǎng)液，PBS漂洗后加入30%過氧化氫和高氯酸(2∶1配制混合液)，80℃孵育1 h裂解細(xì)胞，收集裂解液轉(zhuǎn)移至含閃爍液的 閃爍瓶中，液閃儀檢測氚的放射性計(jì)數(shù)。

表1DNA和RNA寡核苷酸序列Table 1.The sequence of the oligonucleotides

2.8 心肌細(xì)胞表面積大小的檢測(熒光染料染色法) 采用攜帶熒光基團(tuán)的染料鬼筆環(huán)肽(fluorescent phallotoxins)，按說明書操作，染心肌細(xì)胞骨架蛋白F-actinin，DAPI染核，激光共聚焦顯微鏡拍攝心肌細(xì)胞輪廓，進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞的表面積大小，結(jié)果用IPP 6.0軟件分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間差異只有兩組時(shí)用t檢驗(yàn)，有多組時(shí)用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 心肌肥大模型中miR-199a-5p表達(dá)上調(diào)

采用TAAC方法制備大鼠心肌細(xì)胞肥大動(dòng)物模型成功后，取動(dòng)物血漿用qRT-PCR方法檢測miR-199a-5p的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，TAAC組大鼠血漿miR-199a-5p的表達(dá)水平較sham組明顯升高(P＜0.05)。AngⅡ刺激CM 48 h，結(jié)果顯示，AngⅡ組CM miR-199a-5p的表達(dá)水平也較Con組明顯升高(P＜0.05)，提示miR-199a-5p在心肌細(xì)胞肥大動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中均表達(dá)上調(diào)。

Figure 1.Up-regulation of mature miR-199a-5p expression in cardiac hypertrophy models.miRNA expression levels were measured using qRT-PCR.Mature miR-199a-5p was up-regulated in the plasma(A)of TAAC group (n=8)and Ang II-induced cardiomyocytes(B，n= 3).Mean±SEM.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs Con group.圖1 心肌肥大模型中miR-199a-5p的表達(dá)上調(diào)

2 過表達(dá)miR-199a-5p促進(jìn)CM肥大

轉(zhuǎn)染 miR-199a-5p的 mimic，在 CM內(nèi)過表達(dá)miR-199a-5p后，qRT-PCR方法檢測肥大基因心房鈉尿因子(atrial natriuretic factor，ANF)和β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)mRMA的表達(dá)量;氚標(biāo)亮氨酸摻入量檢測細(xì)胞蛋白合成速率的變化;熒光染料染色法檢測心肌細(xì)胞表面積大小變化。結(jié)果如圖2顯示，與NC組比較，過表達(dá)miR-199a-5p后能使肥大基因ANF和β-MHC的表達(dá)量增加，CM合成速率加快，CM表面積增大(均P＜0.05)。

Figure 2.Over-expression of miR-199a-5p promoted cardiomyocyte hypertrophy.The mRNA expression levels of ANF and β-MHC were measured by qRT-PCR(A).The protein synthesis rate were measured by leucine incorporation assay(B).Cardiomyocytes were stained with Alexa Fluor 546 phalloidin and 4＇，6＇-diamidino-2-phenylindole.A blind observation was examined more than 200 cells from randomly acquired images.The relative cell area images were analyzed using Image-Pro Plus 6.0 software(C).Scale bar=50 μm.Mean±SEM.n=3.#P＜0.05 vs NC group.圖2 過表達(dá)miR-199a-5p對CM肥大的作用

3 阻遏miR-199a-5p能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大

轉(zhuǎn)染miR-199a-5p的inhibitor或INC，再用AngⅡ刺激心肌細(xì)胞，qRT-PCR方法檢測ANF和β-MHC mRMA的表達(dá)量;氚標(biāo)亮氨酸摻入量檢測細(xì)胞蛋白合成速率的變化;熒光染料染色法檢測心肌細(xì)胞表面積大小變化。結(jié)果如圖3顯示，在轉(zhuǎn)染miR-199a-5p INC后，AngⅡ同樣能刺激心肌細(xì)胞肥大(使ANF和β-MHC mRMA的表達(dá)量增加，CM合成速率加快，CM表面積加大);但先轉(zhuǎn)染miR-199a-5p的 inhibitor，使細(xì)胞內(nèi)miR-199a-5p作用受阻后，再用AngⅡ刺激CM，則CM不再出現(xiàn)肥大(均P＜0.05)，提示阻遏miR-199a-5p的作用，能抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。

討論

近年來的文獻(xiàn)報(bào)道顯示，在心肌肥大動(dòng)物模型中，miRNAs的表達(dá)譜發(fā)生明顯改變，在心肌肥大的調(diào)控中起重要作用，并指出miRNAs可能會(huì)成為逆轉(zhuǎn)心肌肥大甚至治療心衰的新靶標(biāo)。其中van Rooij等［6］報(bào)道，用主動(dòng)脈縮窄術(shù)或過表達(dá)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶誘導(dǎo)小鼠發(fā)生心臟肥大后，心肌組織中至少有12個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)其中多個(gè)miRNAs的變化與心衰患者心臟組織中的變化相一致。在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)miRNAs過表達(dá)可直接導(dǎo)致細(xì)胞肥大，另外，過表達(dá)miR-195的轉(zhuǎn)基因小鼠最終發(fā)生心衰。van Rooij等［9］的研究結(jié)果認(rèn)為miR-208是心臟肥大、纖維化所必需的，miR-208缺失的小鼠，應(yīng)激誘導(dǎo)時(shí)不產(chǎn)生心臟重構(gòu)和β-MHC的表達(dá)上調(diào)，而miR-208超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠則出現(xiàn)明顯的β-MHC的表達(dá)上調(diào)。Sayed等［10］的小鼠TAAC模型中，術(shù)后第14天，心臟組織miR-26a和miR-26b出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。以上研究報(bào)道證實(shí)miRNAs在心肌肥大病理過程中發(fā)揮重要作用。

Figure 3.The effects of repressing miR-199a-5p on Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy.The mRNA expression levels of ANF and β-MHC were measured by qRT-PCR(A).The protein synthesis rate were measured by leucine incorporation assay (B).Cardiomyocytes were stained with Alexa Fluor 546 phalloidin and 4＇，6＇-diamidino-2-phenylindole.A blind observation was examined more than 200 cells from randomly acquired images.The relative cell area images were analyzed by using Image-Pro Plus 6.0 software(C).The cardiomyocytes were transfected with INC or miR-199a-5p inhibitor，and 24 h later，AngⅡwas added and co-incubated for 48 h.Mean±SEM.n=3.△P＜0.05 vs INC group;#P＜0.05 vs INC+AngⅡgroup.Scale bar=50 μm.圖3 抑制miR-199a-5p對AngⅡ誘導(dǎo)CM細(xì)胞肥大的影響

Chen等［11］的研究結(jié)果顯示，組織器官表達(dá)的miRNA，可以釋放至人的血清和血漿中，并可以用qPCR的方法檢測到，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清中的miRNA能夠抵抗RNA酶A的消化，這種現(xiàn)象使得miRNA很有希望成為臨床診斷腫瘤和其它疾病的無創(chuàng)性生物標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，在鐮狀細(xì)胞性貧血、前列腺癌、肺癌和心肌損傷等疾病中，循環(huán)miRNA均發(fā)生明顯的表達(dá)變化［12-14］，Tijsen等［15］則發(fā)現(xiàn)miR-423-5p在心衰患者的血液循環(huán)中表達(dá)明顯升高，而且與正常人對照和其它疾病導(dǎo)致的呼吸困難患者對照均有差異，認(rèn)為可以把它當(dāng)作心衰患者的循環(huán)生物標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)也做了相關(guān)的嘗試，通過qRT-PCR的方法檢測 TAAC大鼠血漿中miR-199a-5p的含量，發(fā)現(xiàn)其較sham組明顯升高。進(jìn)而我們通過Ang II誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞建立心肌肥大細(xì)胞模型，檢測細(xì)胞內(nèi)miR-199a-5p的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ang II誘導(dǎo)組miR-199a-5p的表達(dá)也較對照組顯著升高，與心肌肥大動(dòng)物模型血漿中miR-199a-5p的含量變化相一致，證明miR-199a-5p在心肌肥大過程中變化顯著。

化學(xué)合成的miRNA擬似物miRNA mimics(雙鏈寡核苷酸)借助脂質(zhì)體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，能夠達(dá)到在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miRNA，進(jìn)而抑制靶基因的目的;導(dǎo)入miRNA的抑制劑(miRNA的反義寡核苷酸，或者稱為antagomirs)則能抑制 miRNA的作用［16-17］。我們通過轉(zhuǎn)染miR-199a-5p的擬似物(mimic)進(jìn)入乳鼠心肌細(xì)胞以過表達(dá)miR-199a-5p，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的肥大基因表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞蛋白合成速率加快，特別是細(xì)胞形態(tài)學(xué)的結(jié)果顯示，過表達(dá)組心肌細(xì)胞表面積較對照組明顯增大，證明miR-199a-5p的過表達(dá)能促進(jìn)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大。接著，我們通過轉(zhuǎn)染miR-199a-5p的抑制劑進(jìn)入 CM，阻遏心肌細(xì)胞內(nèi)源性miR-199a-5p的作用，再用Ang II誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ang II不能再像對照組一樣誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，證明阻遏miR-199a-5p的作用能抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，也提示Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大可能受miR-199a-5p的調(diào)控。miRNA通常通過與靶基因的結(jié)合，抑制或降解靶基因的mRNA，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的負(fù)調(diào)控［18-19］。關(guān)于miR-199a-5p的作用靶點(diǎn)，我們通過生物信息學(xué)軟件(Targetscan，PicTar)預(yù)測和查閱文獻(xiàn)報(bào)道［20］，發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p的靶點(diǎn)可能有缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)，HIF-1α和GSK-3β均可參與心肌肥大的調(diào)控［20-21］，其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，心肌肥大動(dòng)物和細(xì)胞模型中 miR-199a-5p的表達(dá)發(fā)生上調(diào)，在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中過表達(dá)miR-199a-5p能促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，而阻遏miR-199a-5p的作用能抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。研究結(jié)果為進(jìn)一步完善心肌肥大的調(diào)控機(jī)制和miRNA作為循環(huán)生物標(biāo)記物的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Pasquinelli AE.MicroRNAs:deviants no longer［J］.Trends Genet，2002，18(4):171-173.

［2］Brennecke J，Hipfner DR，Stark A，et al.Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila［J］.Cell，2003，113(1):25-36.

［3］Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation［J］.Science，2004，303(5654):83-86.

［4］Zhao Y，Samal E，Srivastava D.Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis［J］.Nature，2005，436(7048):214-220.

［5］Thum T，Galuppo P，Wolf C，et al.MicroRNAs in the human heart:a clue to fetal gene reprogramming in heart failure［J］.Circulation，2007，116(3):258-267.

［6］van Rooij E，Sutherland LB，Liu N，et al.A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(48):18255-18260.

［7］Zhang ZH，Li J，Liu BR，et al.MicroRNA-26 was decreased in rat cardiac hypertrophy model and may be a promising therapeutic target［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2013，62(3):312-319.

［8］張振輝，尤祥宇，劉少軍，等.MicroRNA-29a對大鼠心肌細(xì)胞 Bcl-2和 Mcl-1表達(dá)的調(diào)控作用及其機(jī)制［J］.中國病理生理雜志，2012，28(11):1928-1932.

［9］van Rooij E，Sutherland LB，Qi X，et al.Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA［J］.Science，2007，316(5824):575-579.

［10］Sayed D，Hong C，Chen IY，et al.MicroRNAs play an essential role in the development of cardiac hypertrophy［J］.Circ Res，2007，100(3):416-424.

［11］Chen X，Ba Y，Ma L，et a1.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases［J］.Cell Res，2008，18(10): 997-1006.

［12］Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(30): 10513-10518.

［13］Ai J，Zhang R，Li Y，et al.Circulating microRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391(1):73-77.

［14］Ji X，Takahashi R，Hiura Y，et al.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury［J］.Clin Chem，2009，55 (11):1944-1949.

［15］Tijsen AJ，Creemers EE，Moerland PD，et al.MiR423-5p as a circulating biomarker for heart failure［J］.Circ Res，2010，106(6):1035-1039.

［16］Xiao J，Yang B，Lin H，et al.Novel approaches for genespecific interference via manipulating actions of micro-RNAs:examination on the pacemaker channel genes HCN2 and HCN4［J］.J Cell Physiol，2007，212(2): 285-292.

［17］Wang Z，Luo X，Lu Y，et al.miRNAs at the heart of the matter［J］.J Mol Med，2008，86(7):771-783.

［18］Eulalio A，Rehwinkel J，Stricker M，et al.Target-specific requirements forenhancersofdecappingin miRNA-mediated gene silencing［J］.Genes Dev，2007，21(20): 2558-2570.

［19］Stark A，Brennecke J，Bushati N，et al.Animal micro-RNAs confer robustness to gene expression and have a significant impact on 3＇UTR evolution［J］.Cell，2005，123 (6):1133-1146.

［20］Rane S，He M，Sayed D，et al.Downregulation of miR-199a derepresses hypoxia-inducible factor-1α and Sirtuin 1 and recapitulates hypoxia preconditioning in cardiac myocytes［J］.Circ Res，2009，104(7):879-886.

［21］Antos CL，McKinsey TA，F(xiàn)rey N，et al.Activated glycogen synthase-3β suppresses cardiac hypertrophy in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(2):907-912.

Regulatory effect of miR-199a-5p on cardiomyocyte hypertrophy in rat

ZHANG Zhen-hui1，LI Jiao2，XIONG Xu-ming1，CHEN Wei-yan1，LIU Shi-ming2
(1Intensive Care Unit，2Department of Cardiovascular Medicine，Guangzhou Institute of Cardiovascular Diseases，The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China.E-mail:gzliushiming@126.com)

AIM:To investigate the expression of miR-199a-5p in rat cardiomyocyte hypertrophy models.METHODS:The in vivo cardiomyocyte hypertrophy model was established by transverse abdominal aortic constriction (TAAC)and the in vitro model was induced by angiotensin II.The content of miR-199a-5p was detected by qRT-PCR in the plasma of the TAAC rats and in the cardiomyocytes(CM)of the newborn rats.The CM was isolated and transfected with miR-199a-5p mimic or inhibitor at concentration of 100 nmol/L by Lipofectamine RNAiMAX.The mRNA levels of atrial natriuretic factor(ANF)and β-myosin heavy chain(β-MHC)were detected by qRT-PCR.Tritium-labeled leucine incorporation was employed to determine the protein synthesis rate in the CM.The method of cyto-fluorescent staining was applied to measure the changes of the CM surface area.RESULTS:Compared with control group，the content of miR-199a-5p significantly increased in the TAAC rats and in the CM induced by angiotensin II.In addition，over-expression of miR-199a-5p in the CM up-regulated the mRNA expression of ANF and β-MHC，accelerated the protein synthesis rate and enlarged the CM surface area.In the CM transfected with miR-199a-5p inhibitor following induced by angiotensin II，the hypertrophy effect receded inversely(P＜0.05).CONCLUSION:Over-expression of miR-199a-5p may promote cardiomyocyte hypertrophy，and repression of miR-199a-5p may inhibit cardiomyocyte hypertrophy in the CM.

MicroRNAs;Myocardial hypertrophy;Angiotensin II

R541.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.005

1000-4718(2014)03-0408-06

2013-11-14

2014-01-22

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No.81201453);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2013010014887);廣州市屬

高?？蒲许?xiàng)目(No.2012C230)

△通訊作者Tel:020-34152381;E-mail:gzliushiming@126.com