富徐燕，趙丕文，李亞東，唐雨晴，牛建昭，王鴻捷，李 彧

（1.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京 100029；2.北京市紅十字血液中心，北京 100088）

隨著醫(yī)學的發(fā)展，作為眾多致殘、致死的主要原因的纖維化疾病越來越受到全世界醫(yī)學科研者的關注。組織器官的纖維化是一種病理過程，發(fā)生于多種器官，在炎癥的反復刺激下，器官內(nèi)纖維結締組織異常增生，實質細胞減少，持續(xù)進展可導致器官結構破壞和功能衰退，最終器官衰竭［1］。細胞外基質的過度沉積是器官纖維化發(fā)展的主要原因。過去學者認為組織固有的（?。┏衫w維細胞是細胞外基質生成的主要細胞，但自從1994年Bucala等［2］發(fā)現(xiàn)了循環(huán)纖維細胞后，越來越多的研究證明循環(huán)纖維細胞在纖維化疾病的產(chǎn)生和發(fā)展過程發(fā)揮了重要作用。循環(huán)纖維細胞由骨髓分化而來，存在于外周血中，能在趨化因子的作用下隨血而至，到達損傷部位特異性分化成為功能活躍的（肌）成纖維細胞，分泌細胞外基質，促進纖維化的形成和發(fā)展［3］。姜黃素（curcumin）是從姜科植物姜黃中提取的一種植物多酚，具有降血脂、抗突變、抗癌、抗氧化等生理功能，大量研究表明姜黃素對心、肝、腎、肺等器官的纖維化具有較好的治療效果［4］。目前，尚未見姜黃素對循環(huán)纖維細胞藥理作用影響的研究報道。本實驗旨在通過體外培養(yǎng)人循環(huán)纖維細胞，觀察姜黃素對人循環(huán)纖維細胞增殖分化的影響，探討姜黃素抗多器官纖維化的作用靶點。

1 材料

1.1 血液細胞抗凝濃縮白細胞由北京紅十字血液中心提供。

1.2 主要試劑Ficoll-Paque PLUS（GE-Healthcare）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（Gibco，AUS）；PE Mouse Anti-Human CD34、PE Mouse IgG1 κ Isotype Control、PE-CyTM5 Mouse Anti-Human CD45、PE-CyTM5 Mouse IgG1κIsotype Control、Purified Mouse IgG1κIsotype Control（BD）；Anti-Collagen I antibody［5D8］（Mouse anti-human）、Rabbit anti-Mouse IgG H＆L（FITC）secondary antibody（Abcam）；CCK-8（DOJINDO）；姜黃素（Sigma）

2 方法

2.1 人循環(huán)纖維細胞的分離培養(yǎng)取濃縮白細胞3 ml，用 0.01 mol·L－1無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）等體積稀釋。用注射器抽取淋巴細胞分離液（Ficoll-Paque PLUS）4.5 ml，加入15 ml的離心管中。取血液和PBS的混合液6 ml緩慢加至離心管中，使之分布在淋巴細胞分離的表層，并且上下分層明顯，界面清晰，不混溶。將離心管輕輕放入離心機中，400×g離心35 min。離心后，取出離心管，觀察分層情況，從上至下分別是：血漿層、白膜層（淋巴細胞）、淋巴細胞分離液層、紅細胞層?？焖儆靡埔簶屳p輕穿過血漿層至白膜層，將白膜層細胞全部吸出，放入已經(jīng)加入了9 ml PBS的新離心管中，吹打，使之與PBS混勻。100×g離心10 min。離心后，輕輕取出，用移液槍去除上清液，沉淀的細胞中快速加入9 ml PBS，吹打，混勻。100×g離心10 min。去除上清，沉淀中迅速加入1 ml完全培養(yǎng)液，吹打混勻。

將分得的淋巴細胞按0.75×106的密度接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，細胞置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后去除懸浮細胞，所得貼壁細胞，經(jīng)培養(yǎng)液沖洗后，補充新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3～5 d更換培養(yǎng)液1次。每隔幾天進行細胞的觀察和攝片。

2.2 人循環(huán)纖維細胞的免疫化學鑒定取種植在激光共聚焦專用皿中培養(yǎng)了5 d的循環(huán)纖維細胞，PBS洗滌1次，加入含有PE標記的CD34抗體和PE-Cy5標記的CD45抗體，4℃孵育30 min后，細胞清洗2次。用250μl的固定破膜劑重懸細胞，固定破膜20 min，4℃。加入稀釋10倍的清洗液清洗細胞兩次后，用含10%牛血清白蛋白的PBS 4℃封閉15 min。加COLⅠ一抗，4℃過夜。用稀釋10倍的清洗液清洗細胞2次后，加入FITC標記的兔抗鼠IgG二抗，4℃暗室作用30 min。加入稀釋10倍的清洗液清洗細胞兩次后，加入PBS，采用激光共聚焦顯微鏡觀察攝片。

2.3 人循環(huán)纖維細胞的流式鑒定將培養(yǎng)5 d的貼壁細胞經(jīng)預冷PBS洗滌，用0.5%EDTA的胰酶消化細胞，離心收集，去除上清液。加 PE標記的CD34抗體和PE-Cy5標記的CD45抗體，4℃孵育30 min后，細胞清洗2次。用250μl的固定破膜劑重懸細胞，固定破膜20 min，4℃。加入稀釋10倍的清洗液1 ml清洗細胞兩次。用含10%牛血清白蛋白的PBS 4℃封閉15 min。離心收集細胞后，加入COLⅠ一抗，4℃過夜。用稀釋10倍的清洗液清洗細胞3次，加入FITC標記的兔抗鼠IgG二抗，4℃暗室作用30 min。加入稀釋10倍的清洗液清洗細胞2次后，加入PBS混勻，過濾后上機檢測。除了實驗組外，同時設對照組和補償組。所用的同型對照有：PEmouse IgG1 isotype control，PE-Cy5 Mouse IgG1 isotype control，Purified Mouse IgG1 isotype control。

2．4 CCK-8測定姜黃素對人循環(huán)纖維細胞增殖的影響將培養(yǎng)6 d的細胞以5×104的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育72 h后，加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液配制的不同濃度的姜黃素溶液（1、3、10、20μmol·L－1）100μl，分別培育 24、48、72 h。反應結束后，去除舊的培養(yǎng)基，加入新的不含藥物的培養(yǎng)基后，每孔加入10μl的CCK-8溶液，設置DMSO對照組、空白對照組，繼續(xù)孵育3 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

2．5 姜黃素對人循環(huán)纖維細胞COLⅠ表達的影響

將培養(yǎng)6 d的貼壁細胞去除培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍后，將培養(yǎng)液換成含不同濃度姜黃素（1、3、10、20μmol·L－1）的培養(yǎng)液，孵育72 h后，消化收集細胞。細胞經(jīng)COLⅠ的免疫染色（方法同“2.2”循環(huán)纖維細胞的流式鑒定），用流式細胞儀檢測。同時設對照組，所用的同型對照為Purified Mouse IgG1 isotype control。

2.6 數(shù)據(jù)處理所有實驗結果均用±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析。

3 結果

3.1 人循環(huán)纖維細胞的培養(yǎng)與觀察隨著培養(yǎng)時間的延長和持續(xù)的換液，可見培養(yǎng)瓶中的循環(huán)纖維細胞越來越純凈，雜細胞越來越少。形態(tài)學方面，細胞不斷伸展擴大，所產(chǎn)生的觸角也愈多，表明細胞的貼壁能力越來越強。培養(yǎng)4 d，可見大量的梭形細胞和少量星形細胞，多為群聚在一起。11 d時，細胞的生長趨向穩(wěn)定，不再大量遷移，細胞已經(jīng)延展變得扁平，在細胞周圍可見大量觸角，有眾多的梭形細胞。15 d時，細胞更加扁平鋪展，梭形細胞減少，開始出現(xiàn)巨噬細胞樣細胞。22 d時，細胞繼續(xù)延展，整個視野的細胞分布趨于純化，梭形細胞更加減少，巨噬細胞樣細胞增多，見Fig 1。

Fig 1 Human circulating fibrocytes after different culturing time by inverted m icroscope（×20）

3.2 人循環(huán)纖維細胞的鑒定通過對培養(yǎng)的貼壁細胞進行免疫染色，采用激光共聚焦技術進行觀察，可見細胞呈現(xiàn)CD45和COLⅠ強陽性，而CD34表達很弱（Fig 2）。細胞流式技術顯示99.9%的貼壁細胞呈COLⅠ陽性，79.7%的細胞為CD45陽性，只有3.3%細胞呈CD34陽性（Fig 3）。

Fig 2 Positive CD45 and COLⅠ coexpression in human blood fibrocytes by confocalm icroscopic system（×60）

3.3 姜黃素對人循環(huán)纖維細胞增殖的影響應用CCK-8法進行細胞增殖試驗，與正常對照組相比，姜黃素對人循環(huán)纖維細胞的增殖作用呈現(xiàn)劑量和時間效應。作用24 h后，不同濃度的姜黃素皆可促進細胞的增殖，其中3μmol·L－1的姜黃素促細胞增殖能力最強（P＜0.05）。作用 48 h后，低濃度（1、3 μmol·L－1）的姜黃素依然能促進細胞增殖，而高濃度（10、20μmol·L－1）則發(fā)揮了細胞增殖抑制作用。當作用72 h時，不同濃度的姜黃素均可抑制人循環(huán)纖維細胞的增殖，而且姜黃素濃度越大，對細胞增殖的抑制能力越強（P＜0.01），（Tab 1和Fig 4）

3．4 姜黃素對人循環(huán)纖維細胞COLⅠ表達的影響

Fig 3 Positive CD34，CD45 and COLⅠ coexpression in human circulating fibrocytes by flow cytometry

Fig 4 Effect of curcum in on proliferation ofhuman circulating fibrocytes by CCK-8

采用流式細胞術分析了姜黃素對人循環(huán)纖維細胞表面抗體COLⅠ的相對表達的影響（Fig 5）。結果顯示在DMSO對照組中，COLⅠ陽性的細胞比率為99.8%，當姜黃素濃度為1μmol·L－1時，COLⅠ陽性的細胞率降低至99.3%。隨著姜黃素濃度的增加，可表達COLⅠ的細胞數(shù)也相應地減少（3μmol·L－1：95.8%；10μmol·L－1：94.7%）。姜黃素濃度達到20μmol·L－1時，陽性細胞降至87.5%。

4 討論

纖維化是臨床上常見的病理生理改變，是在創(chuàng)傷、感染、炎癥、血液循環(huán)障礙及免疫反應等多種機體內(nèi)外致病因素作用下，以細胞外基質（ECM）異常沉積為特征的各種疾病的不良結局，是機體對損傷的一種反應［5］。過去認為受損組織本身的成纖維細胞或肌成纖維細胞是ECM產(chǎn)生的主要活化細胞，其活化作用是纖維化疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵進程。然而，成纖維細胞和肌成纖維細胞的來源卻頗受爭議，最初的研究認為它們來源于組織固有的纖維細胞，而近年來研究發(fā)現(xiàn)它們還可能由上皮細胞經(jīng)上皮細胞－間充質轉化（EMT）轉化而來，也可由血液中骨髓來源的前體細胞——循環(huán)纖維細胞轉化而來［6－7］。

Tab 1 Effect of curcum in on proliferation of human circulating fibrocytes by CCK-8

Fig 5 Effect of curcum in on COLⅠexpression of human circulating fibrocytes by flow cytometry

研究表明循環(huán)纖維細胞來源于骨髓，存在于外周血中，是一種過渡性細胞，能在損傷的刺激作用下大量合成，并通過各種不同的細胞因子的介導從外周血中轉移進入受損的組織或器官。進入受損部位的循環(huán)纖維細胞不僅自身可合成ECM參與纖維化進程，而且也可分化成為（?。┏衫w維細胞來發(fā)揮生理性和病理性的纖維化作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)纖維細胞的表面標記物有20多種［8－9］，而目前用于鑒定不同病理損傷部位中的循環(huán)纖維細胞的公認標準是同時具有膠原生成和血源來源性標記，即COLⅠ和CD34雙陽性或COLⅠ和CD45雙陽性［10］。

本實驗從人外周血中提取淋巴細胞進行培養(yǎng)，當細胞分化為循環(huán)纖維細胞后，再進行姜黃素的各項實驗。倒置顯微鏡觀察可見人循環(huán)纖維細胞在早期時多為梭形細胞，并伴有少量星形細胞，與文獻報道［11］一致。隨著時間的推移和細胞的生長分化，細胞持續(xù)延展平鋪，慢慢發(fā)展形成扁圓狀的巨噬細胞樣細胞，與已有的文獻［13］一致。

CD34是高度糖基化的跨膜糖蛋白，能選擇性地表達于人類及其他哺乳動物造血干/祖細胞表面，具有運輸造血干細胞從骨髓轉移進入外周血的作用［12］。而本實驗中CD34的少量表達表明循環(huán)纖維細胞具有骨髓來源性，與已有的循環(huán)纖維細胞表面標志物表達的研究［9－10］一致。本研究發(fā)現(xiàn)在人循環(huán)纖維細胞培養(yǎng)的的初期，僅有3.3%的細胞呈CD34陽性，與 Liu等［13］實驗中的2.99%相接近。CD45為白細胞共同抗原，廣泛存在于造血系細胞如T細胞、B細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞表面［6］，在淋巴細胞的發(fā)育成熟、功能調節(jié)及信號傳遞中具有重要意義。CD45的高表達體現(xiàn)了循環(huán)纖維細胞的血系特點，越來越廣泛地用于循環(huán)纖維細胞的鑒定。COLⅠ蛋白是成纖維細胞的經(jīng)典標志蛋白，COLⅠ的高表達證明循環(huán)纖維細胞具有致纖維化潛能，可以轉分化為成纖維細胞。本實驗中COLⅠ和CD45雙陽性的細胞比率為79.7%，符合目前循環(huán)纖維細胞的鑒定標準。目前，國內(nèi)外對于循環(huán)纖維細胞的研究尚未成熟，極少有關于藥物對循環(huán)纖維細胞作用的研究報告。

姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種植物多酚，是姜黃發(fā)揮藥理作用最重要的活性成分［14］，具有抗心、肝、腎、肺等器官纖維化的功效，且無毒、副作用小的優(yōu)勢及多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)的作用特點。以往的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對受損組織固有的纖維細胞，如肝星形細胞［15－16］、腎小球系膜細胞［17］、肺泡Ⅱ型細胞［18］，以及發(fā)生 EMT的上皮細胞［19］具有明顯的藥理作用。本實驗探討了姜黃素對具有骨髓來源的人循環(huán)纖維細胞的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度（20 μmol·L－1）的姜黃素在長時間（72 h）作用下可明顯抑制人循環(huán)纖維細胞的增殖和COLⅠ的表達。

綜上所述，姜黃素可調控循環(huán)纖維細胞的增殖，并抑制其向成纖維細胞轉化。由此推測循環(huán)纖維細胞可能成為姜黃素抗多器官纖維化的作用靶點，其發(fā)揮作用途徑尚需進一步的研究。

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