楊景哲,溫海玲,耿琪瑛,陳鳳平,馮欣姝

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科,承德 067000)

rhGM-CSF及納米銀對深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合過程血管化的影響*

楊景哲,溫海玲,耿琪瑛,陳鳳平,馮欣姝

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科,承德 067000)

目的 研究外用重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和納米銀敷料外用,對深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面組織愈合及血管化的影響。方法用Wistar大鼠建立深Ⅱ度燙傷模型,分為A、B、C組。A組(n=30):凡士林紗布覆蓋,B組(n=30):納米銀敷料覆蓋,C組(n=30):rhGM-CSF涂抹創(chuàng)面。傷后第1,4,7,10,14,21天,觀察創(chuàng)面病理學(xué)改變,按照酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平,采用實(shí)時-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法,檢測創(chuàng)面愈合過程中缺血壞死因子-1α(HIF-1α)mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果病理學(xué)改變:A、B、C組均在第10天出現(xiàn)明顯的血管化;創(chuàng)面愈合率:C組＞B組＞A組,第14天、第21天時,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。VEGF水平:傷后第1天3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),第4,7,10,14天3組間及第21天A組和C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HIF-1αmRNA相對表達(dá)量:A組第14天達(dá)峰值,B組、C組逐漸增大,第10天達(dá)峰值,隨后下降,且C組下降幅度最明顯,第1天A組與B組、C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),第4天,3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),第7天A組與C組之間及第10,14,21天各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論rhGM-CSF和納米銀外用,促進(jìn)深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合過程中血管化的形成,并且rhGM-CSF血管化程度優(yōu)于納米銀。

重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子;納米銀;燙傷創(chuàng)面;血管內(nèi)皮生長因子;缺血壞死因子

燙傷創(chuàng)面外用敷料的研究,尤其是對于深Ⅱ度創(chuàng)面,是目前的燙傷研究的熱點(diǎn),重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rhGM-CSF)是基因工程產(chǎn)物,外用rhGM-CSF主要通過適度炎癥反應(yīng)、促進(jìn)角化上皮細(xì)胞增殖以及促進(jìn)局部新生血管形成等機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用[1]。納米銀敷料主要通過抗感染作用加速創(chuàng)面愈合,其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用已經(jīng)被充分證實(shí)[2]。本研究旨在通過建立深Ⅱ度燙傷大鼠模型,研究外用rhGM-CSF及納米銀對缺血壞死因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)mRNA和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)的影響,探討二者在促進(jìn)血管化方面的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 Wistar大鼠,SPF級,90只,體質(zhì)量200～220 g,雌雄各半,由天津山川紅實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司購買,動物許可證號:SCXK(津)2009-0001。大鼠于實(shí)驗(yàn)室條件下的動物房內(nèi),溫度(24±3)℃,常規(guī)配方飼料喂養(yǎng)和自來水飲水,按照國家衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。水合氯醛1 mL·kg-1腹腔注射麻醉,背部去毛后用99℃紗布覆蓋10 s,造成約4 cm× 4 cm深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面(病理切片證實(shí)),傷后創(chuàng)面分別用A、B、C 3種方法處理,每組30只。A組:凡士林紗布覆蓋;B組:0.9%氯化鈉溶液濕潤納米銀醫(yī)用抗菌敷料(深圳市愛杰特醫(yī)藥科技有限公司)覆蓋,A組、B組敷料完全覆蓋創(chuàng)面即可;C組:rhGM-CSF(長春金賽藥業(yè)有限公司)涂抹創(chuàng)面,每次涂抹約2 g。A組、B組、C組大鼠創(chuàng)面每天換藥,分別于傷后第1,4,7,10, 14,21天留取皮膚標(biāo)本1 cm×1 cm,留取血標(biāo)本一份約3 mL,至第21天,終止實(shí)驗(yàn)。

1.2 創(chuàng)面病理觀察 創(chuàng)面換藥時分別于傷后第1,4, 7,10,14,21天觀察各組創(chuàng)面炎癥反應(yīng)情況,創(chuàng)面組織標(biāo)本在蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色情況下觀察細(xì)胞浸潤、血管通透性、炎細(xì)胞趨化及血管化程度。

1.3 創(chuàng)面愈合率計(jì)算 創(chuàng)面攝相,計(jì)算創(chuàng)面愈合面積,計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率(%)=(創(chuàng)面總面積-殘余創(chuàng)面面積)/創(chuàng)面總面積×100%。

1.4 VEGF檢測 血清標(biāo)本解凍,按照酶聯(lián)免疫吸附法測定各標(biāo)本血清中VEGF水平,試劑盒購買自武漢華美生物工程有限公司,按照說明書操作。

1.5 HIF-1αmRNA水平的檢測 將組織標(biāo)本加入Trizol,用Trizol總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度和純度,重復(fù)測定3次,A260和A280之比值應(yīng)在118～210,計(jì)算樣品總RNA濃度。引物序列為:HIF-1αcDNA擴(kuò)增的上游引物5′-AACAAACAGAATCTGTCCTCAAACC-3′,下游引物5′-CAGGTAATGGAGACATTGCCAG-3′,產(chǎn)物片段長度為296 bp;β-actic上游引物5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′,下游引物5′-ACTCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′,擴(kuò)增片段長度220 bp。取總RNA 1μg,加入Oligo(dT)18 Primer,70℃溫育5 min;迅速放入冰浴中,加入10mmol·L-1dNTP,RNA酶抑制劑,5×緩沖液,42℃溫育5 min;冰浴中加入5 U·μL-1AMV逆轉(zhuǎn)錄酶,加入DEPC處理水至總體積20μL, 42℃溫育60 min,70℃10min,立置冰上,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒎磻?yīng)管置于PCR(美國MJ公司PTC-220)儀上,95℃預(yù)變性10 min后,進(jìn)入95℃變性1 min,50℃退火15 min,72℃延伸10 min的循環(huán),共34次,最后72℃充分延伸10 min。反應(yīng)完成后取PCR反應(yīng)液10μL,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,用PCRMarker作分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳完畢后在紫外熒光數(shù)字成像儀下觀察結(jié)果。以每只大鼠HIF-1α與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度的比值作為HIF-1αmRNA的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS16.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。F檢驗(yàn)比較創(chuàng)面愈合率及VEGF、HIF-1α mRNA相對表達(dá)量在同時間點(diǎn)各組的差異,SNK-q檢驗(yàn)比較同時間點(diǎn)組內(nèi)兩兩比較的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面病理學(xué)表現(xiàn) A、B、C 3組均在第10天出現(xiàn)明顯的血管化,A組創(chuàng)面?zhèn)蠹t腫明顯,切片可見大量炎性細(xì)胞浸潤、聚集、遷移,血管壁通透性增加,血管化程度不高(圖1A);B組創(chuàng)面?zhèn)蠹t腫,在傷后第4天炎癥反應(yīng)最重,切片可見炎性細(xì)胞浸潤、聚集、遷移,血管壁通透性增加,血管化程度較A組加快,至第14天因?yàn)閯?chuàng)面溶痂,炎癥反應(yīng)較前略有加重(圖1B);C組創(chuàng)面?zhèn)蠹t腫,較A、B組明顯減輕,切片可見適量炎性細(xì)胞浸潤、聚集、遷移,血管壁通透性增加,血管化進(jìn)程最快(圖1C)。

2.2 創(chuàng)面愈合率 在傷后第1,4,7天各組創(chuàng)面均未出現(xiàn)愈合,第10,14,21天創(chuàng)面愈合率C組＞B組＞A組。第10天,3組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);第14,21天,3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 血清VEGF水平 A組VEGF水平在燙傷后一直逐漸上升,B組、C組逐漸上升,第14天達(dá)到峰值,第21天水平下降,可能與B組、C組第21天創(chuàng)面溶痂完成,局部微循環(huán)改善有關(guān),血管化程度降低,尤其是C組下降幅度最大。VEGF水平在第1天各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),第4,7,10,14天各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),第21天,A組、C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.4 HIF-1αmRNA的相對表達(dá)量 HIF-1α與βactin擴(kuò)增產(chǎn)物均顯示為清晰的條帶。HIF-1α與βactin條帶吸光度的比值作為HIF-1αmRNA相對表達(dá)量,結(jié)果顯示,HIF-1αmRNA相對表達(dá)量,A組持續(xù)增大,第14天達(dá)峰值,B組、C組逐漸增大,第10天達(dá)峰值,隨后逐漸下降,可能與創(chuàng)面溶痂快慢、局部壞死組織脫落程度及缺血、缺氧程度有關(guān),且C組下降幅度最明顯。第1天A組與B組、C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),第4天,3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),第7天A組與C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),第10,14,21天3組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

3 討論

A.A組;B.B組;C.C組圖1 3組大鼠燙傷后第14天創(chuàng)面血管化情況(HE染色,×200)A.group A;B.group B;C.group CFig.1 Vascularization of wound surface in three groups of rats 14 days after burn(HE staining,×200)

表1 3組大鼠不同時間點(diǎn)愈合率比較Tab.1 Healing rate of three groups of rats at different time points %

正常的燙傷創(chuàng)面愈合要經(jīng)歷肉芽生成、血管新生、膠原沉積和組織重塑等階段,而創(chuàng)傷中的新生血管為其提供營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子以及排出代謝產(chǎn)物[3-4]。燙傷發(fā)生后創(chuàng)面缺血、缺氧致使HIF-1α表達(dá)升高,進(jìn)而上調(diào)VEGF,VEGF能促進(jìn)血管生成,改善局部微循環(huán),從而加速創(chuàng)面愈合過程。rhGM-CSF作為組織工程產(chǎn)物,能趨化中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、VEGF、HIF-1α、表皮生長因子、血小板衍生生長因子等活化或表達(dá),一方面,控制創(chuàng)面炎癥反應(yīng),而臨床治療中多直接選擇復(fù)方環(huán)丙沙星[5]等抗菌藥物對抗創(chuàng)面炎癥反應(yīng),另一方面,啟動細(xì)胞因子,加速局部血管化程度,改善微循環(huán),進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[6],并且在燙傷殘余創(chuàng)面治療上有獨(dú)特的優(yōu)勢[7]。納米銀敷料是采用納米技術(shù),將單質(zhì)銀制成粒徑約為25 nm的銀微粒,銀離子的緩慢釋放使其具有持續(xù)殺菌、減輕創(chuàng)面感染的特點(diǎn),燙傷創(chuàng)面可分泌大量基質(zhì)金屬蛋白酶,不利于創(chuàng)面的愈合,而納米銀抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的作用促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合[8]。本研究結(jié)果提示,創(chuàng)面治愈率C組最快,A組最慢,在第10天,A組、B組、C組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),考慮為深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)剛開始啟動,各組自身優(yōu)勢相比不明顯,第14,21天,A組、B組、C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),證明B組、C組在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面較A組有明顯優(yōu)勢,并且rhGM-CSF比納米銀敷料在加速創(chuàng)面愈合方面作用更加突出。

深Ⅱ度燙傷發(fā)生后,皮膚及皮下毛細(xì)血管網(wǎng)在熱力作用下?lián)p傷或栓塞,使組織局部缺血缺氧。缺血缺氧是誘導(dǎo)血管新生因子釋放的最主要因素[9],低氧分壓可誘導(dǎo)VEGF mRNA的表達(dá)[10]。VEGF是HIF-1α的一個重要靶基因,也是血管生成的主要調(diào)節(jié)因子[11],在缺氧條件下,VEGF能被HIF-1α誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)錄激活,尤其是各種組織細(xì)胞在創(chuàng)傷及血管新生過程中。

VEGF是目前已知的一種最強(qiáng)的血管生成因子,其在正常組織中合成水平很低,但在外傷愈合過程VEGF可高表達(dá)[12],主要通過新生血管作用調(diào)節(jié)局部組織血管結(jié)構(gòu)變化,以及血管源性水腫等生理、病理過程[13]。在病理及生理的血管生成中都是必不可少的誘導(dǎo)因子,其高效特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,有強(qiáng)烈的促分裂和趨化作用,形成血管萌芽和管腔,并可增強(qiáng)微血管通透性,誘導(dǎo)新血管形成[14]。本研究結(jié)果提示,A組VEGF水平在燙傷后一直逐漸上升,B組、C組逐漸上升,上升趨勢較A組明顯,第14天達(dá)到峰值,第21天水平下降,可能與B組、C組第21天創(chuàng)面溶痂完成,大部創(chuàng)面愈合,局部組織缺血缺氧逐漸改善,血管化程度有所降低有關(guān),C組尤然。VEGF水平在第1天各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),說明燙傷早期創(chuàng)面發(fā)生應(yīng)激性反應(yīng),機(jī)體修復(fù)機(jī)能未完全啟動;第4, 7,10,14天各組間及第21天A組與C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),在促進(jìn)創(chuàng)面血管化方面,B組、C組優(yōu)于A組,并且C組優(yōu)于B組,即rhGM-CSF在促進(jìn)深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面血管新生方面有優(yōu)勢。

表2 3組深Ⅱ度燙傷大鼠血液VEGF水平Tab.2 Serum level of VEGF in three groups of rats with deepⅡdegree burn pg·mL-1,±s

表2 3組深Ⅱ度燙傷大鼠血液VEGF水平Tab.2 Serum level of VEGF in three groups of rats with deepⅡdegree burn pg·mL-1,±s

與A組同時間點(diǎn)比較,*1P＜0.05,與B組同時間點(diǎn)比較,*2P＜0.05Compared with group A at the same time point,*1P＜0.05;compared with group B at the same time point,*2P＜0.05

組別大鼠/只第1天第4天第7天第10天第14天第21天A組30 23.01±1.73 23.18±1.64 23.55±1.48 20.81±1.43 19.54±1.07 25.76±1.46 B組30 23.09±1.10 24.61±1.25*126.38±1.13*127.05±1.37*129.73±1.58*126.27±2.10 C組30 23.23±1.66 25.43±1.41*1*230.81±1.44*1*233.47±1.26*1*238.91±2.38*1*227.11±1.91*1

表3 3組深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面H IF-1αm RNA相對表達(dá)量水平Tab.3 Relative expression of HIF-1αmRNA in wound surface of three groups of rats with deepⅡdegree burn ±s

表3 3組深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面H IF-1αm RNA相對表達(dá)量水平Tab.3 Relative expression of HIF-1αmRNA in wound surface of three groups of rats with deepⅡdegree burn ±s

與A組同時間點(diǎn)比較,*1P＜0.05,與B組同時間點(diǎn)比較,*2P＜0.05Compared with group A at the same time point,*1P＜0.05;compared with group B at the same time point,*2P＜0.05

組別大鼠/只第1天第4天第7天第10天第14天第21天A組30 2.18±0.21 2.35±0.22 3.29±0.50 4.87±0.38 6.36±0.56 5.72±0.45 B組30 2.30±0.10*12.41±0.13 3.21±0.37 4.23±0.41*14.17±0.26*13.43±0.23*1C組30 2.28±0.17*12.44±0.15 3.01±0.33*13.78±0.22*1*23.57±0.19*1*22.75±0.32*1*2

HIF-1α是缺氧的特異感受因子,其基本作用是對缺氧產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng),反應(yīng)細(xì)胞缺氧狀態(tài),調(diào)節(jié)氧平衡,通過轉(zhuǎn)錄活化編碼VEGF基因[15],誘導(dǎo)VEGF的表達(dá),從而促成血管新生。本研究結(jié)果提示,HIF-1α mRNA相對表達(dá)量,A組于傷后第14天出現(xiàn)高峰,第21天出現(xiàn)下降,而B、C組第10天出現(xiàn)高峰,第14天開始下降,可能與創(chuàng)面溶痂快慢、局部壞死組織脫落程度及缺血、缺氧程度有關(guān),創(chuàng)面局部新生血管生成后使氧平衡得到改善,因此HIF-1α及其調(diào)控因子VEGF的表達(dá)相應(yīng)下調(diào)[16-17]。第1天A組與B組、C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),可能與rhGM-CSF和納米銀外用,趨化性的啟動機(jī)體應(yīng)激性反應(yīng),傳遞細(xì)胞信號,啟動修復(fù)機(jī)制;第4天,A組損傷機(jī)制的啟動,使差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;第10,14,21天各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),證明rhGM-CSF和納米銀在促進(jìn)創(chuàng)面溶痂,啟動血管生成,改善局部缺血、缺氧,加速創(chuàng)面血管化方面比凡士林有明顯優(yōu)勢,并且,rhGM-CSF比納米銀有優(yōu)勢。HIF-1α促進(jìn)創(chuàng)面血管化機(jī)制可能與蛋白激酶C及磷脂酰肌醇激酶活化有關(guān)[18],啟動HIF-1α轉(zhuǎn)錄,上調(diào)VEGF的表達(dá),刺激血管新生。相關(guān)研究認(rèn)為,HIF-1α通過誘導(dǎo)VEGF基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生既能使缺氧細(xì)胞存活,改善微循環(huán),完善供氧系統(tǒng),又通過誘導(dǎo)P53等基因表達(dá),促使細(xì)胞凋亡,降低耗氧量[19]。

燙傷創(chuàng)面外用敷料的研究逐漸趨向復(fù)合生物材料,rhGM-CSF和納米銀敷料外用均能改善深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面血管化程度,但是rhGM-CSF優(yōu)勢更加明顯。能否將二者聯(lián)合應(yīng)用,充分利用凝膠保濕和納米銀敷料的敷料架構(gòu)作用,其相關(guān)發(fā)生機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.008

Effect of Recombinant Human Granulocyte/macrophage Colony-stimulating Factor and Nano-silver on Neovascularization in Healing Process of Skin with DeepⅡDegree Burn

YANG Jing-zhe,WEN Hai-ling,GENG Qi-ying,CHEN Feng-ping,FENG Xin-shu
(Department of Burns and Plastic Surgery,Affiliated Hospital ofChengde Medical College,Chengde 067000,China)

Objective To observe the effect of recombinant human granulocyte/macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF)and nano-silver as treatment for skin with deepⅡdegree burn.MethodsDeepⅡdegree burn Wistar rat model was established.The rats were randomly divided into three groups,petrolatum treatment group(group A,n=30),nanosilver treatmentgroup(group B,n=30),and rhGM-CSF treatmentgroup(group C,n=30).The pathological changes ofwound of the three groupswere observed 1,4,7,10,14 and 21 days after the treatment.The concentration of VEGF in serumswasmeasured with ELISA.The levels of HIF-1αmRNA expression were detected by RT-PCR.ResultsOn day 10,neovascularization developed in groups A,B and C.Healing rate of the wound was the highest in group C,lowest in group A,with significant differences among the three groups on day 14 and day 21(P＜0.05).VEGF level peaked on day 14 in group A,and on day 10 in groups B and C.There were significant differences in VEGF level on day 1 between group A and groups B,C,on day 7 between group A and group C,on day 10,14 and 21 among the three groups(P＜0.05),but no significant differences on day 4 among the three groups.ConclusionrhGM-CSF and nano-silver treatment can accelerate neovascularization of wound,and rhGM-CSF is better than nano-silver.

Recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor;Nano-silver;Burn wound;Vascular endothelial growth factor;Hypoxia inducible factor

R986;R644

A

1004-0781(2014)12-1570-05

2013-12-23

2014-06-11

*河北省2013年醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃指令性課題(20130024);承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20122164)

楊景哲(1980-),男,河北承德人,主治醫(yī)師,碩士,主要從事燒傷創(chuàng)面愈合機(jī)制研究。電話:0314-2279277,E-mail:sanyue_1@sina.com。

耿琪瑛(1954-),女,河北承德人,主任醫(yī)師,教授,學(xué)士,研究方向:燒傷難愈性創(chuàng)面治療及異體皮臨床應(yīng)用。電話:0314-2279276,E-mail:sanyue_1@aliyun.com。