汪 仁,蔡黎麗,徐 晟,李曉丹,夏 冰

〔江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園),江蘇南京210014〕

石蒜Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因LrMGT的克隆與分析

汪 仁,蔡黎麗,徐 晟,李曉丹,夏 冰①

〔江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園),江蘇南京210014〕

從石蒜〔Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.〕葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中克隆獲得Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體(MGT)基因LrMGT。序列分析結(jié)果顯示:LrMGT基因的cDNA序列全長(zhǎng)1 726 bp,其中開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度921 bp,編碼306個(gè)氨基酸。石蒜LrMGT基因編碼的氨基酸序列的理論相對(duì)分子質(zhì)量為33 635,理論等電點(diǎn)為pI 5.14,為疏水性膜蛋白,不具有信號(hào)肽。序列比對(duì)結(jié)果表明:石蒜LrMGT基因編碼的氨基酸序列與小米〔Setaria italica(Linn.)Beauv.〕、水稻(Oryza sativa Linn.)和擬南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕等植物的MGT基因編碼的氨基酸序列的相似性較高,相似度達(dá)到72%～76%;石蒜LrMGT基因與其他植物MGT基因編碼的氨基酸序列的保守區(qū)域較大,均具有較高的保守性。在NJ系統(tǒng)樹(shù)上石蒜LrMGT基因編碼的氨基酸序列與禾本科(Gramineae)植物二穗短柄草〔Brachypodium distachyum(Linn.)Beauv.〕、水稻、高粱〔Sorghum bicolor(Linn.)Moench〕和小米MGT基因編碼的氨基酸序列聚為同一個(gè)分支,表明它們可能具有較近的進(jìn)化關(guān)系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明:石蒜LrMGT基因在根和鱗莖中的相對(duì)表達(dá)量較高,在葉片和花中的相對(duì)表達(dá)量較低,具有明顯的組織特異性。

石蒜;Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體;基因克隆;序列分析;同源性;表達(dá)特性

Mg2+是高等植物細(xì)胞中最豐富的二價(jià)陽(yáng)離子,也是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的核心營(yíng)養(yǎng)元素之一,參與各種生理生化反應(yīng),例如,Mg2+是葉綠素的組成成分,可促進(jìn)光合作用的碳同化[1];參與維持類囊體膜兩側(cè)的電荷平衡[2];調(diào)節(jié)葉綠體不同光系統(tǒng)之間激發(fā)能的分配;維持葉綠體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定等[3]。此外,Mg2+不僅可以作為ATP的輔助因子,還是細(xì)胞內(nèi)許多酶(包括RNA聚合酶、磷酸化酶、激酶及羧化酶等)的活化劑,調(diào)節(jié)酶活性;Mg2+還參與跨膜電子梯度的建立,以維持細(xì)胞內(nèi)的滲透勢(shì)、穩(wěn)定細(xì)胞膜[4]。近年來(lái)的研究結(jié)果還顯示:Mg2+可調(diào)控葉綠體mRNA的穩(wěn)定性[5],并在植物抗病[6]和抗金屬Al脅迫中起作用[7-8]。

為了適應(yīng)土壤中Mg2+含量的變化以及應(yīng)付其他形式的脅迫,植物體必須嚴(yán)格控制Mg2+的轉(zhuǎn)運(yùn)。在生物界中已知結(jié)構(gòu)類型并各具特點(diǎn)的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體(MGT)家族主要包括5大類:Mg2+/H+交換體、鈷抗性蛋白家族(CorA,Cobalt resistance A)、P型磷酸酶(P-type phosphatase)、離子通道和Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族(MgtE,magnesium transport E)[9]。高等植物中已鑒定出Mg2+/H+交換體和CorA-like鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩類具有Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)活性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10-12]。

石蒜〔Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.〕是重要的觀賞和藥用植物,其鱗莖中含有多種生物堿,包括石蒜堿、石蒜胺堿、石蒜倫堿、偽石蒜堿和加蘭他敏等,其中,加蘭他敏具有強(qiáng)效的可逆乙酰膽堿酯酶(AChE, acetylcholinesterase)抑制活性和神經(jīng)元煙堿受體構(gòu)象調(diào)節(jié)作用,臨床上用于治療阿爾茨海默氏病和小兒麻痹癥等[13]。近年來(lái),對(duì)石蒜屬(Lycoris Herb.)植物功能基因的研究取得了一定進(jìn)展,已對(duì)多個(gè)功能基因進(jìn)行了克隆、測(cè)序及表達(dá)特征的分析和驗(yàn)證[14-20]。在前期工作的基礎(chǔ)上,作者從石蒜全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中克隆獲得1個(gè)Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因,并利用生物信息學(xué)對(duì)該基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析,以期為石蒜功能基因研究提供更全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為更加全面了解石蒜MGT基因(LrMGT)的生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的石蒜新鮮葉片采自江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所苗圃,石蒜葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)為本實(shí)驗(yàn)室保存[21]。

植物總RNA提取試劑Trizol reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer(Mg2+free)、MgCl2、dNTPs mixture、DL2000 DNA marker、pMD18-T載體、T4 DNA連接酶和SYBR Premix Ex Taq試劑盒等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DNA純化回收試劑盒購(gòu)于上海華舜生物工程有限公司;大腸桿菌菌株DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存;其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 LrMGT基因的克隆和測(cè)序 參考GenBank已公布的水稻(Oryza sativa Linn.)OsMGT(登錄號(hào)NM_ 001051488)、大豆〔Glycine max(Linn.)Merr.〕GmMGT (登錄號(hào)XM_003526843)、Solanum lycopersicum Linn. SlMGT(登錄號(hào)XM_004250314)、葡萄(Vitis vinifera Linn.)VvMGT(登錄號(hào)XM_002272566)、二穗短柄草〔Brachypodium distachyum(Linn.)Beauv.〕BdMGT(登錄號(hào)XM_003564692)、野草莓(Fragaria vesca Linn.) FvMGT(登錄號(hào)XM_004288586)、小米〔Setaria italica (Linn.)Beauv.〕SiMGT(登錄號(hào)XM_004970679)以及擬南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕AtMGT (登錄號(hào)XM_004970679)的保守序列設(shè)計(jì)引物。根據(jù)核苷酸序列比對(duì)結(jié)果獲得1對(duì)PCR引物PMGT,上游引物序列為5′-AGCTTCATCATCAAGAAGAAGGG-3′、下游引物序列為5′-CCAGACCAATCCTTGAACAT TAT-3′。

取保存于-75℃超低溫冰箱中的石蒜葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)20 μL,用滅菌LB液體培養(yǎng)基將菌液稀釋10倍,均勻涂布在含有30 μg·mL-1氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上,于恒溫(37℃)條件下倒置培養(yǎng)過(guò)夜(或培養(yǎng)16 h)。隨機(jī)挑取分散均勻的單菌落,利用引物PMGT進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。選取陽(yáng)性克隆交由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序;結(jié)合序列比對(duì),獲得該克隆的全長(zhǎng)cDNA序列。

1.2.2 LrMGT基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列分析 檢測(cè)并去除所測(cè)序列兩端的載體序列(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/),利用NCBI-ORF Finder軟件(http:∥www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/gorf/)分析出目標(biāo)序列的開(kāi)放閱讀框(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)。

采用ProtParam(http:∥www.expasy.org/tools/ protparam.html)分析蛋白質(zhì)的氨基酸組成;利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTp及DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),相關(guān)植物種類的MGT氨基酸序列均來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù);利用DNAMAN軟件進(jìn)行疏水性/親水性鑒定;利用SignalP軟件分析N末端信號(hào)肽序列(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/);利用TMHMM軟件進(jìn)行LrMGT蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/);利用SOPMA(http:∥npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu);使用MEGA5.0軟件中的鄰接法(NJ, neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 LrMGT基因的組織表達(dá)特性分析 參照高純度總RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明,分別從石蒜成熟植株的根、鱗莖、葉片和花等組織中提取總RNA,并根據(jù)DNA消化酶說(shuō)明書(shū)中的方法對(duì)總RNA中的DNA進(jìn)行消化。取1 μg已消化的總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)的操作步驟、利用Oligo(dT)18和反轉(zhuǎn)錄酶MMLV(RNase H-)合成cDNA第1鏈。根據(jù)克隆獲得的LrMGT基因序列設(shè)計(jì)特異引物,上游引物序列為5′-TATAGAAATAGATGAGCGTGTC-3′、下游引物序列為5′-CTTGAAGATGAAGCTGGATC-3′;以石蒜Actin為內(nèi)參設(shè)計(jì)表達(dá)檢測(cè)引物,上游引物序列為5′-CATCCCTCAGCACCTTCCAG-3′、下游引物序列為5′-CTGGGATGCAAAAACCGCC-3′。采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng);相對(duì)定量使用參照基因的ΔCt法,表達(dá)差異采用2-ΔΔCt表示[22]。

2 結(jié)果和分析

2.1 石蒜LrMGT基因全長(zhǎng)cDNA序列克隆及分析

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的石蒜葉片的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù),利用特異引物從中分離出LrMGT基因。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序并去除載體序列,獲得了石蒜Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因LrMGT的序列。該序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為KJ651960。

LrMGT基因的序列分析結(jié)果表明:石蒜LrMGT基因cDNA序列全長(zhǎng)1 726 bp,包括1個(gè)長(zhǎng)度為921 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF,open reading frame),編碼306個(gè)氨基酸(圖1)。ProtParam分析結(jié)果表明:LrMGT基因編碼的氨基酸序列的理論相對(duì)分子質(zhì)量為33 635,理論等電點(diǎn)為pI 5.14。

圖1 石蒜LrMGT基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence of LrMGT gene from Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.and its encoded amino acid sequence

圖2 石蒜LrMGT基因與其他植物MGT基因編碼的氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果Fig.2 Result of multiple alignment of amino acid sequences encoded by LrMGT gene from Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.and MGT gene from other species

2.2 石蒜LrMGT基因及其他植物MGT基因編碼的氨基酸序列比較及同源性分析

BLASTp分析結(jié)果顯示:石蒜LrMGT基因編碼的氨基酸序列屬于EmrE超基因家族,與小米、水稻、二穗短柄草、高粱〔Sorghum bicolor(Linn.)Moench〕、葡萄、野草莓、Solanum lycopersicum、鷹嘴豆(Cicer arietinum Linn.)、大豆和擬南芥的MGT基因編碼的氨基酸序列相似性較高,相似度達(dá)到72%～76%。

將石蒜LrMGT基因編碼的氨基酸序列與其他植物MGT基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)(圖2),結(jié)果顯示:石蒜LrMGT基因及其他植物MGT基因編碼的氨基酸序列的保守區(qū)域均較大,且連續(xù)的相同氨基酸數(shù)目較多,表明MGT基因編碼的氨基酸序列具有高度的保守性。

為進(jìn)一步分析從石蒜中分離的LrMGT基因編碼的氨基酸序列與其他植物MGT基因編碼的氨基酸序列的親緣關(guān)系,構(gòu)建了NJ系統(tǒng)樹(shù)(圖3)。結(jié)果表明:石蒜LrMGT基因編碼的氨基酸序列與同屬于禾本科(Gramineae)的二穗短柄草、水稻、高粱和小米的MGT基因編碼的氨基酸序列親緣關(guān)系較近,聚在同一個(gè)分支上。

2.3 石蒜LrMGT基因編碼的LrMGT蛋白的生物信息學(xué)分析

使用ProtParam對(duì)石蒜LrMGT基因編碼的LrMGT蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示:石蒜LrMGT蛋白的分子式為C1558H2427N367O426S18,半衰期(half-life)為30 h,不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)為35.29,脂肪族氨基酸指數(shù)(aliphatic index)為118.50。

利用DANMAN軟件對(duì)石蒜LrMGT基因編碼的LrMGT蛋白進(jìn)行疏水性/親水性分析(圖4),結(jié)果表明:該蛋白質(zhì)的第21位纈氨酸(Val)疏水性最強(qiáng),第74位亮氨酸(Leu)和第13位苯丙氨酸(Phe)的疏水性次之;第286位組氨酸(His)和第287位賴氨酸(Lys)的親水性最強(qiáng)?？傮w上看,石蒜LrMGT蛋白屬于疏水性蛋白。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示:α螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲是LrMGT蛋白中較多的結(jié)構(gòu)元件,還含有少量的β轉(zhuǎn)角。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:LrMGT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含43.79%的α螺旋、26.80%的延伸鏈、21.57%的無(wú)規(guī)則卷曲和7.84%的β轉(zhuǎn)角。而跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖5)表明:LrMGT蛋白擁有7個(gè)跨膜區(qū),分別是12～34、38～60、67～86、101～123、136～158、173～192和199～221,無(wú)信號(hào)肽。

圖3 石蒜LrMGT基因與其他植物MGT基因編碼的氨基酸序列的NJ系統(tǒng)樹(shù)Fig.3 NJ phylogenetic tree of amino acid sequences encoded by LrMGT gene from Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.and MGT gene from other species

圖4 石蒜LrMGT基因編碼的LrMGT蛋白的疏水性(A)和親水性(B)Fig.4 Hydrophobicity(A)and hydrophilicity(B)of LrMGT protein encoded by LrMGT gene from Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.

圖5 石蒜LrMGT基因編碼的LrMGT蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Transmembrane structure analysis on LrMGT protein encoded by LrMGT gene from Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.

2.4 石蒜LrMGT基因的組織表達(dá)特性分析

石蒜不同組織中LrMGT基因相對(duì)表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果(圖6)顯示:石蒜LrMGT基因在石蒜根、鱗莖、葉片和花中的相對(duì)表達(dá)量差異較大。其中,LrMGT基因在石蒜根中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次為鱗莖;而在葉片和花中的相對(duì)表達(dá)量較低。由此可見(jiàn),LrMGT基因在石蒜中的表達(dá)具有一定的組織特異性。

圖6 石蒜不同組織中LrMGT基因相對(duì)表達(dá)量的比較Fig.6 Comparison on relative expression of LrMGT gene in different tissues of Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.

3 討 論

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,已經(jīng)從不同植物中克隆到多個(gè)MGT基因,并對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、生化和生理功能等進(jìn)行了研究[2]。作者以前期構(gòu)建的高質(zhì)量石蒜葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ),克隆獲得了石蒜LrMGT基因的全長(zhǎng)cDNA序列。石蒜LrMGT基因與其他植物MGT基因編碼的氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果表明:LrMGT基因編碼的氨基酸序列與小米、水稻和擬南芥等植物MGT基因編碼的氨基酸序列的同源性較高,相似性達(dá)到72%～76%,說(shuō)明MGT基因序列在物種間具有保守性。另外,在NJ系統(tǒng)樹(shù)上,石蒜與禾本科植物二穗短柄草、水稻、高粱和小米聚為同一個(gè)分支,在進(jìn)化上具有相對(duì)較近的關(guān)系,說(shuō)明石蒜與禾本科植物在進(jìn)化上可能具有一定的關(guān)系。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,石蒜根、鱗莖、葉片和花中LrGMT基因的相對(duì)表達(dá)量有明顯差異,根中LrGMT基因的相對(duì)表達(dá)量最高、鱗莖中次之、花中最低?？梢?jiàn),該基因的表達(dá)具有較明顯的組織特異性。

擬南芥Mg2+/H+交換體AtMHX是第1個(gè)從多細(xì)胞有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,有11個(gè)跨膜區(qū)域,長(zhǎng)度為100個(gè)氨基酸[23];AtMHX定位在液胞膜上,主要存在于木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中[2];此外,擬南芥MGT家族(AtMGTs/AtMRS2s)屬于CorA類Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)家族,有10個(gè)成員,其氨基酸序列有15%～89%相同,整個(gè)家族有6個(gè)修飾保守區(qū)[11];這些轉(zhuǎn)運(yùn)體在不同的組織和細(xì)胞器中起作用,且大多是膜蛋白。根據(jù)這些功能結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可將這個(gè)大家族分為5個(gè)亞家族: AtMGT1和AtMGT2,AtMGT3和AtMGT4,AtMGT5和AtMGT6,AtMGT7、AtMGT8和AtMGT9,AtMGT10[11],其中AtMGT10屬于單獨(dú)的亞家族。在本研究中,膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示石蒜LrMGT蛋白擁有7個(gè)跨膜區(qū),同樣屬于膜蛋白。因此,LrMGT蛋白究竟屬于哪種類型的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。植物的MGT蛋白除了具有Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能外,在Al脅迫抗性中也有一定作用[24],而且MGT蛋白還參與了花粉管的發(fā)育[25]。因此,石蒜LrMGT基因在植物體內(nèi)具有的功能還需要進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯:張明霞)

Cloning and analysis on Mg2+transporter gene LrMGT from Lycoris radiata WANG Ren,CAI

Lili,XU Sheng,LI Xiaodan,XIA Bing①(Institute of Botany,Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210014,China),J.Plant Resour.&Environ.2014,23(4):1-7

Mg2+transporter(MGT)gene LrMGT was cloned from the full-length cDNA library in leaf of Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.Result of sequence analysis shows that the full-length of cDNA sequence of LrMGT gene is 1 726 bp with an open reading frame(ORF)of 921 bp,which encodes 306 amino acids.The theoretical relative molecular weight of the amino acid sequence encoded by LrMGT gene from L.radiata is 33 635 and its theoretical isoelectric point is pI 5.14,and which is hydrophobic membrane protein without signal peptide.The result of sequence alignment shows that amino acid sequence encoded by LrMGT gene from L.radiata possesses higher similarity to those encoded by MGT gene from Setaria italica(Linn.)Beauv.,Oryza sativa Linn.and Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.,etc,with similarity degree of 72%-76%.There is large conserved region in all of the amino acid sequences encoded by LrMGT gene from L.radiata and MGT gene from other species,which possess high conservation.In NJ phylogenetic tree,the amino acid sequences encoded by LrMGT gene from L.radiata and by MGT gene from other species in Gramineae such as Brachypodium distachyum(Linn.)Beauv.,O.sativa,Sorghum bicolor(Linn.)Moench and S.italica are clustered together,meaning that these species have the closer evolution relationship.The real-time fluorescence quantitative PCR result shows that the relative expression of LrMGT gene from L.radiata is higher in root and bulb and lower in leaf and flower with an obvious tissue specificity.

Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.;Mg2+transporter;gene cloning;sequence analysis; homology;expression characteristics

Q785;Q943.2

A

1674-7895(2014)04-0001-07

10.3969/j.issn.1674-7895.2014.04.01

2014-05-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31301798);江蘇省鹽土生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(JKLBS2012010)

汪 仁(1975—),男,安徽宿松人,博士,副研究員,主要從事植物栽培生理等方面的研究。

①通信作者E-mail:xiabingnbg@sina.com