李國秀，李建科，馬文哲

（1. 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2. 陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

石榴（Punica grantum L.）為石榴科石榴屬植物，別名安石榴、若榴、丹若、金罌、金龐、涂林、天漿等，在我國栽培廣泛，主要分布于陜西、山東、安徽、四川和云南五省。石榴自古以來就是一種藥食兩用植物，其果實不僅營養(yǎng)豐富，而且富含多種生理活性物質(zhì)。近代科學(xué)研究證實，石榴果實具有預(yù)防和治療心腦血管疾病、肝病、癌癥以及延緩衰老、增強機體免疫力等功效，而這些功效很可能來自于果實中的多酚類物質(zhì)[1-6]。本研究以石榴果實為研究對象，以石榴汁以及石榴加工副產(chǎn)物果皮、籽粒廢渣為原料，在前期對其各部位（皮、汁、渣）多酚進行提取和純化工藝研究的基礎(chǔ)上，進一步考察和比較了不同來源的石榴多酚抗氧化活性，以進一步揭示石榴的功能價值，也可為石榴多酚的合理開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凈皮甜石榴（Punica granatum‘jingpitian’） 為收獲季節(jié)采收陜西臨潼的成熟石榴；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH·，C18H12N5O6)美國Sigma公司生產(chǎn)；茶多酚（純度99%） 上海哈靈生物科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

JFSD-70實驗室粉碎磨 上海市嘉定糧油檢測儀器廠；HHW-21CU-600電熱恒溫水浴鍋 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；KQ3200B 型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TDL-4型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；WFJ 2000型可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；ALPHA1-4型真空冷凍干燥機 德國 CHRTST公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；精密微量移液器 德國 Eppendorf；H-1微型混和器 上海康禾光電儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 三種來源的石榴多酚提取物的制備 石榴的預(yù)處理：新鮮石榴，手工去皮剝籽。石榴皮經(jīng)自然風(fēng)干后粉碎備用，其水分含量為7.78%；石榴籽粒（即可食部分）用組織搗碎機破碎后，用200目紗布四層過濾，分別收集石榴渣和石榴汁。石榴汁迅速采用4000r/min離心10min，取上清液于-18℃條件下貯存；石榴渣置于干燥箱中50℃條件下鼓風(fēng)干燥36h后粉碎備用，其水分含量為5.27%。

石榴皮、石榴渣多酚的制備：石榴皮/渣→干燥→粉碎→過篩（40目）→超聲輔助溶劑浸提（60%乙醇、溫度60℃、料液比1∶20、時間30min、超聲功率120W）→過濾→離心→上清液為多酚粗提液→減壓蒸餾回收溶劑→有機溶劑萃取法純化富集（石油醚、氯仿萃取除雜，乙酸乙酯萃取富集）→減壓蒸餾回收溶劑→真空冷凍干燥→石榴皮/渣多酚提取物。

石榴汁多酚的制備：取石榴原汁采用有機溶劑萃取法（石油醚、氯仿萃取除雜，乙酸乙酯萃取富集）進行多酚的純化富集，減壓蒸餾除去溶劑后真空冷凍干燥，得到石榴汁多酚提取物。

提取物中總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu比色法（FC法）[7]，以沒食子酸為標(biāo)樣。

多酚得率（%）= 提取物中多酚質(zhì)量/原料質(zhì)量×100

多酚純度（%）= 提取物中多酚質(zhì)量/提取物質(zhì)量×100

1.2.2 體外抗氧化活性測定 將三種來源的石榴多酚提取物以總酚質(zhì)量濃度為標(biāo)準(zhǔn)，分別配制成不同總酚濃度的溶液作為樣品溶液，避光、低溫保存?zhèn)溆?。每個測定項目均以茶多酚、BHT（二丁基羥基甲苯）作為陽性對照。

總還原能力的測定：采用普魯士蘭法，參照Kaur等[8]的方法測定。清除超氧陰離子自由基（O2·-）能力測定：采用核黃素-光-氮藍四唑體系測定[9]。清除羥自由基（·OH）能力測定：采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定[10]。清除DPPH·活性測定：參考Negi等[11]和 Kaur等[8]的方法測定?？怪|(zhì)過氧化能力的測定：采用張爾賢等[12]確定的方法測定。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用DPS Ver.3.01數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種來源的石榴多酚提取物的制備結(jié)果

采用超聲波輔助提取法優(yōu)化工藝對石榴皮、石榴渣中多酚類物質(zhì)進行提取，粗提液總酚得率分別為石榴皮23.68%、石榴渣0.69%。經(jīng)有機溶劑萃取法純化富集后，石榴皮提取物總酚得率為5.88%，總酚含量為79.83%；石榴渣提取物總酚得率為0.13%，總酚含量為23.76%。經(jīng)測定，石榴原汁中總酚含量為0.75%，經(jīng)有機溶劑萃取法純化富集后，石榴汁提取物總酚含量為10.56%。

2.2 石榴多酚的還原能力

圖1 石榴多酚的總還原能力Fig.1 Deoxidization capability of pomegranate polyphenols

采用普魯士蘭法測定多酚的總還原能力，吸光度越大，表示其還原能力越強，抗氧化活性越高。從圖1中看出，隨著總酚質(zhì)量濃度的增加，吸光度增大，并且在測定的濃度范圍（5～100mg/L）內(nèi)，其劑量效應(yīng)關(guān)系表現(xiàn)為良好的直線相關(guān)性。當(dāng)濃度均為60mg/L時，三種石榴多酚的還原能力略低于茶多酚，但明顯高于BHT，表明三種石榴多酚均具有較強的還原能力。EC50是根據(jù)線性方程求出的吸光度達0.5時所需樣品的總酚濃度，該值越小，表示還原力越強。根據(jù)EC50的比較，三種來源的石榴多酚還原能力強弱為：石榴渣多酚（EC50＝53.75mg/L）＞石榴皮多酚（EC50＝54.70mg/L）＞石榴汁多酚（EC50＝59.45mg/L）。

2.3 石榴多酚對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力

圖2 石榴多酚對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力Fig.2 Scavenging effects of pomegranate polyphenols on Superoxide anion radical

由圖2可以看出，總的來說，三種石榴多酚提取物對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力均隨著總酚濃度的增大而增強，在總酚濃度為1～30mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，進一步增大濃度則其清除率變化減小。三種石榴多酚對超氧陰離子自由基的清除能力強弱順序為：石榴渣多酚（IC50＝14.66mg/L）＞石榴汁多酚（IC50＝18.88mg/L）＞石榴皮多酚（IC50＝22.41mg/L）。當(dāng)總酚濃度達到70 mg/L時，三種石榴多酚的清除率相近，分別為石榴渣多酚 83.19%、石榴汁多酚 81.23%、石榴皮多酚 78.43%。當(dāng)濃度為20mg/L時，石榴渣多酚的清除率與茶多酚相當(dāng)，石榴汁多酚和石榴皮多酚的清除率要低于茶多酚，但三者清除率均明顯高于BHT，為BHT的2.80～3.88倍，表明三種石榴多酚對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力均較強。

2.4 石榴多酚對羥自由基（·OH）的清除能力

圖3 石榴多酚對羥自由基（·OH）的清除作用Fig.3 Scavenging effects of different pomegranate polyphenols on hydroxyl radical

如圖3所示，在一定的濃度范圍（100～500mg/L）內(nèi)，石榴多酚對羥自由基的清除作用隨著其濃度的增大而增強，其劑量效應(yīng)關(guān)系表現(xiàn)為較好的直線關(guān)系，但繼續(xù)增大濃度時，清除率變化減小。根據(jù)IC50值判定，三種石榴多酚清除羥自由基能力大小為：石榴汁多酚（IC50＝308.70mg/L）＞石榴渣多酚（IC50＝331.50mg/L）＞石榴皮多酚（IC50＝350.31mg/L）。在實驗的最大濃度 700mg/L時，三種樣品清除率差別很小，分別為：石榴皮多酚84.21%、石榴汁多酚86.27%、石榴渣多酚84.66%。當(dāng)濃度均為400 mg/L時，三種石榴多酚對羥自由基的清除能力與茶多酚相近，為BHT的4.69～5.34倍，說明三種石榴多酚均具有較強的羥自由基清除能力。

2.5 石榴多酚對DPPH·的清除作用

圖4 石榴多酚對DPPH·的清除作用Fig.4 Scavenging effects of different pomegranate polyphenols on DPPH·

從圖4可看出，三種石榴多酚對DPPH·均有較強的清除能力，在較低的濃度下即可達到較高的清除率；隨著濃度的增大，其清除作用也增強，在1～10mg/L的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。根據(jù)IC50值顯示，三種石榴多酚對DPPH·的清除能力的大小為：石榴汁多酚（IC50＝3.89mg/L）＞石榴渣多酚（IC50＝4.74mg/L）＞石榴皮多酚（IC50＝5.33mg/L）。在測試的最大濃度30 mg/L時，三種樣品的清除率差異不大，分別為石榴汁多酚91.98%、石榴皮多酚90.97%、石榴渣多酚88.89%。當(dāng)濃度為10mg/L時，三種石榴多酚對DPPH自由基的清除能力與茶多酚相當(dāng)，且明顯高于BHT，為BHT的4.21～4.64倍。

2.6 石榴多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制能力

圖5 石榴多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of pomegranate polyphenols on peroxidation of polyunsaturated fatty acid from yelk lipoprotein induced by Fe2+

由圖5可看出，三種來源的石榴多酚對Fe2+誘導(dǎo)的卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化均有較強的抑制作用，當(dāng)總酚濃度小于30mg/L時，它們的抑制率隨著濃度的增大而迅速增大，其量效關(guān)系呈現(xiàn)較好的直線相關(guān)性。從IC50判斷，三種石榴多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制能力強弱為：石榴渣多酚（IC50=12.29mg/L）＞石榴汁多酚（IC50=17.66mg/L）＞石榴皮多酚（IC50=24.37mg/L）。當(dāng)總酚濃度為50mg/L時，它們的抑制率很接近，但均小于茶多酚和BHT。當(dāng)總酚濃度大于50mg/L時，抑制率變化不大，曲線趨于平緩，但三種樣品的抑制率高低發(fā)生了變化，在測定的最大濃度200mg/L時各試樣抑制率大小關(guān)系為：石榴皮多酚（82.66%）＞石榴渣多酚（81.54%）＞石榴汁多酚（79.44%）。

3 結(jié)論與討論

石榴是一種功能價值很高的水果，近年來有關(guān)石榴多酚的研究報道較多，但大多著眼于石榴某一部位的多酚提取工藝和活性的研究，缺乏系統(tǒng)、全面的分析研究。本研究是在前期對石榴各部位進行多酚提取和組成研究的基礎(chǔ)上，進一步對三種來源的石榴多酚進行了抗氧化活性的比較分析。從還原能力、清除自由基能力和抗脂質(zhì)過氧化能力三個方面對石榴多酚抗氧化活性進行測定，并在自由基清除能力方面采用了三個體系：DPPH自由基體系、超氧陰離子自由基體系和羥自由基體系，較為全面地分析了石榴多酚的抗氧化能力。研究表明，石榴皮多酚、石榴汁多酚、石榴渣多酚均具有較強的體外抗氧化和清除自由基活性，且在一定范圍內(nèi)多酚濃度與其抗氧化能力成良好的線性關(guān)系。但三種來源的石榴多酚在不同評價體系中的抗氧化能力不具有一致性，其中石榴渣提取物的還原能力、對超氧陰離子自由基清除能力和抗脂質(zhì)過氧化能力最強，而石榴汁提取物對羥自由基和 DPPH自由基清除能力最強。總體來說，在總酚質(zhì)量濃度相同的情況下，石榴渣多酚和石榴汁多酚的抗氧化活性要高于石榴皮多酚，該結(jié)果與 Seeram等[13]的研究結(jié)果具有一致性。

根據(jù)前期研究和文獻報道[14－18]，石榴不同部位酚類物質(zhì)組成和含量存在顯著差異，這可能是導(dǎo)致三種來源的石榴多酚抗氧化活性存在差異的主要原因。有機溶劑萃取法操作簡便、快速，適合于以實驗室應(yīng)用為目的的多酚的純化富集，本研究所采用的多酚提取物是通過前期所研究開發(fā)的石榴多酚有機溶劑萃取純化富集工藝進行制備的，該工藝對于石榴皮多酚的純化效果較好，多酚提取物純度達到79.83%，而對于石榴渣和石榴汁多酚的純化效果不太理想，提取物樣品中一些非多酚抗氧化物質(zhì)的存在，可能會對其抗氧化活性起到協(xié)同作用，從而增強其抗氧化能力[13]。多酚物質(zhì)與其抗氧化活性之間的具體構(gòu)效關(guān)系，還需要在對石榴多酚進行進一步的組分分離、結(jié)構(gòu)鑒定等基礎(chǔ)上進行分析。

[1]Fuhrman B，Volkova N，Aviram M. Pomegranate juice inhibits oxidzed LDL uptake and cholesterol biosynthesis in macrophages[J]. Journal of Nutritional Biochemistry，2005，16(9)：570-576.

[2]Filomena N，Sharon W I，Vincenzo S，et al. Effects of a Pomegranate Fruit Extract rich in punicalagin on oxidation-sensitive genes and eNOS activity at sites of perturbed shear stress and atherogenesis[J]. Cardiovascular Research，2007，73：414-423.

[3]Mira R，Tony H，Michael A. Antioxidative effects of pomegranate juice (PJ)consumption by diabetic patients on serum and on macrophages[J]. Atherosclerosis，2006，187：363-371.

[4]Kim N D，Mehta R，Yu W P，et al. Chemopreventive and adjuvant therapeutic potential of pomegranate (Punica granatum)for human breast cancer [J]. Breast Cancer Research and Treatment，2002，71：203-217.

[5]陸雪瑩，熱依木古麗·阿布都拉，李艷紅，等. 新疆石榴皮總多酚有效部位的抗氧化、抗菌及抗腫瘤活性[J].食品科學(xué)，2012，33（09）：26－30.

[6]楊麗娜，林茜，付中喜，等. 石榴多酚對小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國老年學(xué)雜志，2010，30（09）：2488－2489.

[7]Singleton V L，Rossi J A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic - phosphotungstic acid reagents[J]. Am J Enol Vitic，1965，16：144-158.

[8]Kaur G，Jabbar Z，Athar M，et al. Punica granatum (pomegranate)flower extract possesses potent antioxidant activity and abrogates Fe-NTA induced hepatotoxicity in mice[J].Food and Chemical Toxicology，2006，44：984-993.

[9]Beauchamp C, Irwin F. Superoxide dismutase: Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels[J].Analytical Biochemistry，1971，44(2)：276-287.

[10]龐戰(zhàn)軍，周玫，陳瑗.自由基醫(yī)學(xué)研究方法[M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：14-15.

[11]Negi P S，Jayaprakasha G K，Jena B S. Antioxidant and antimutagenic activities of pomegranate peel extracts [J].Food Chemistry，2003，80：393-397.

[12]張爾賢，俞麗君，周意琳，等. Fe2+誘發(fā)脂蛋白PUFA過氧化體系及對若干天然產(chǎn)物抗氧化作用的評價[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，1996，28(2)：218-222.

[13]Seeram N P，Adams L S，Henning S M，et al. In vitro antiproliferative, apoptotic and antioxidant activities of punicalagin,ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice [J].Journal of Nutritional Biochemistry，2005，16(6)：360-367.

[14]李建科，李國秀，趙艷紅，等. 石榴皮多酚組成分析及其抗氧化活性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(11)：4035－4041.

[15]韓玲玲，苑兆和，馮立娟，等.不同石榴品種果實成熟期酚類物質(zhì)組分與含量分析[J].果樹學(xué)報，2013，30（1）：99－104.

[16]彭海燕.石榴不同品種及不同部位多酚含量的比較研究[D].成都：西華大學(xué)，2012.

[17]葉天. 陜西石榴籽的抗氧化特性及活性成分分析[D].上海：上海交通大學(xué)，2012.

[18]韓玲玲，苑兆和，馮立娟，等.石榴果實酚類物質(zhì)測定體系優(yōu)化與不同部位組分及含量測定[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44(11)：112－116.