趙欣，李貴節(jié)

(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程系，重慶400067)

老鷹茶是一種樟科木姜子屬植物，學(xué)名毛豹皮樟的嫩莖葉進(jìn)行簡單的工藝處理制成的一種茶葉。老鷹茶原產(chǎn)于貴州的大婁山，現(xiàn)在在我國南方幾個(gè)省份也有分布，包括重慶和四川[1-3]。老鷹茶是我國南方少數(shù)民族長久以來使用的一種植物代用茶，但是現(xiàn)在在一些大城市也被作為一種涼茶飲用，重慶、成都的老鷹茶相當(dāng)于北京的大碗茶，是大眾化的茶品[4]。老鷹茶具強(qiáng)烈的樟科植物芳香味，性甘涼，有消暑解渴和消食去脹的功效，是一種天然的野生清涼解熱飲料[5]。傳統(tǒng)飲茶方式是用熱水沖泡茶葉，在沖泡過程中大量的揮發(fā)性成分散失，泡茶過程中聞到的香氣就是這些揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生的。近年來關(guān)于茶葉香氣成分的研究已經(jīng)陸續(xù)展開，對綠茶、紅茶和茉莉花茶成分的研究已經(jīng)取得了進(jìn)展，西湖龍井含有30余個(gè)組分；紅茶經(jīng)過了發(fā)酵含有更多的組分，有接近 50個(gè)組分；茉莉花茶相對成分較為簡單，含有不足10種的組分[6-8]，但是這些研究都局限于其組成，對這些香氣成分的功能性作用的研究還未見有深入研究。其他的一些茶品香氣物質(zhì)的研究也急待研究，其中老鷹茶香氣成分的作用還未見有研究，本研究對四川出產(chǎn)老鷹茶的香氣成分進(jìn)行了分析并對其功能性效果進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

老鷹茶 市售四川蒙露茶業(yè)公司出品野生老鷹茶;無水乙醚(色譜純)、癸酸乙酯(色譜純)、無水硫酸鈉(分析純)上海士瑞化工實(shí)業(yè)有限公司； NaH2PO4.2H2O、FeCl3、三氯乙酸 廣州化學(xué)試劑廠;2-硫代巴比妥酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、抗壞血酸、D- Biotin、L- histidine·HCl (monohydrate)、D- glucose- 6- phosphate、NADP 美國Sigma公司；DMSO 日本純正化學(xué)株式會社；RPMI 1640 培養(yǎng)液、FBS、trypsin、EDTA、100unit/mL Penicillin- Streptomycin 美國 Gibco公司；N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)美國Aldrich公司;TA100營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙氏菌 美國Sigma公司；AGS 胃癌細(xì)胞株、HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞株 韓國細(xì)胞株銀行。

LS-B75L型高壓蒸氣滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；WPL-30型恒溫培養(yǎng)箱 江東精密儀器有限公司；SDE裝置 天長市華玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV-1750型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Agilent 7890/5975 GC-MS（配置電子轟擊源） 美國安捷倫公司；VS-15CFN型冷凍離心機(jī) 韓國Vision科學(xué)株式會社；MC096型二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋電機(jī)株式會社；Elx800型酶標(biāo)儀 美國 Bio Tekinstruments公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 老鷹茶香氣物質(zhì)的提取 取打碎的老鷹茶葉樣品50g于SDE裝置的2L圓底燒瓶中，加入煮沸的蒸餾水1L，同時(shí)加入10-4g/mL濃度的癸酸乙酯0.5mL以及少許玻璃珠，用50mL重蒸乙醚萃取。對電熱套加熱，微沸下提取20min。乙醚萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分。4℃靜置24h后用N2濃縮提取至0.2mL，重復(fù)過程5次，將5次收集到的提取液合并，冷凍干燥后溶入DMSO備用[9]。

1.2.2 氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)測定老鷹茶的成分和含量 GC分析條件：HP-5 MS柱，30m×0.25 mm×0.25μm；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為高純氦氣(He)，恒流模式，流速為1.0mL/min；初始溫度50℃，保留1min，10℃/min升至220℃，保持1min，5℃/min，升至280℃，保持4min，50℃/min，升至300℃，保持 2min。進(jìn)樣量：1.0mL；進(jìn)樣方式：不分流。EI-MS分析條件：離子源溫度：280℃；電離能量：70ev；溶劑延遲時(shí)間：4min；電子轟擊電離源(EI)。得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對照標(biāo)準(zhǔn)譜庫對老鷹茶香氣成分進(jìn)行確認(rèn)。并且通過各香氣組分的峰面積占總峰面積的比值來表示各組分的相對含量。

1.2.3 羥基自由基清除能力測定 將6mol/L濃度的deoxyribos溶液0.2mL，pH7.4的磷酸鈉緩沖溶液0.2mL，400mmol/L濃度的FeCl3溶液0.2mL，400mmol/L濃度的FeSO4-EDTA溶液0.2mL，3mol/L濃度的H2O2溶液0.2mL，400mmol/L濃度的抗壞血酸溶液0.2mL和0.2mL老鷹茶香氣物質(zhì)溶液混合，在37℃水浴中放置60min，再加入1mL的三氯乙酸，1mL的2-硫代巴比妥酸，混合溶液在90℃水浴中煮沸20～25min后在532nm處測定吸光度，計(jì)算清除自由基能力[10]。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測定 將100μL不同濃度老鷹茶香氣物質(zhì)和60μL的0.15mmol/L的DPPH自由基試劑混勻后加入96孔板中室溫下避光放置30min，再在540nm波長下測定光度值。測得的OD數(shù)值按公式計(jì)算：清除DPPH自由基能力(%)=[（對照值-對照空白值）-（樣品值-樣品空白值）]×100/( 對照值-對照空白值)[11]，對照組為沒有加入樣品孔，空白組為加入樣品但沒有加入DPPH自由基試劑孔。

1.2.5 Ames抗突變實(shí)驗(yàn) 老鷹茶香氣物質(zhì)提取物設(shè)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量組（1.25、2.5mg/皿）、自發(fā)回變組和對照組，每組設(shè)3個(gè)平行皿。滅菌的試管中加入磷酸鹽緩沖液、濃度為 1～2×109個(gè)/mL的培養(yǎng) 12h后的菌株0.1mL、樣品物質(zhì)提取物溶液50μL和致突變物（MNNG）50μL。輕微震蕩后37℃下放置30min后加入頂層培養(yǎng)基2mL混合，再倒在底層培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)計(jì)算結(jié)果。抑制率（%）=[（對照組菌落數(shù)-樣品處理組菌落數(shù)）/（對照組菌落數(shù)-自發(fā)回變組菌落數(shù)）]×100[5]。

1.2.6 MMT法測定老鷹茶香氣物質(zhì)提取物的體外癌細(xì)胞增值抑制效果 將 AGS胃癌細(xì)胞和 HT- 29結(jié)腸癌細(xì)胞復(fù)蘇后接種在含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，將癌細(xì)胞放置在5%的CO2的培養(yǎng)箱中在37℃下培養(yǎng)，每周更換培養(yǎng)液2～3次并進(jìn)行傳代培養(yǎng)一次。按每孔200μL將含癌細(xì)胞培養(yǎng)液接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)液的癌細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL。然后將96孔培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。吸出96孔板中各孔的培養(yǎng)液，加入含老鷹茶香氣物質(zhì)提取物的培養(yǎng)液200μL。再經(jīng)過48h培養(yǎng)后，再次吸出各孔內(nèi)上清液，各孔再加入200μL濃度5mg/mL的MTT試劑后繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸出各孔內(nèi)的上清液，在每孔中加入200μL的DMSO后避光振蕩30min，用酶標(biāo)儀在540nm波長下測定各孔OD值，按公式：抑制率(%)=[(空白孔OD值-樣品孔OD值)/空白孔OD值]×100計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[12]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 老鷹茶香氣成分的分析

由圖1和2可以看出，通過GC-MS分析，老鷹茶香氣物質(zhì)中主要含有7H-二苯并[b,g]咔唑（5.600min），癸烷（6.082min），1H-吲哚（9.123min），丙烯酮（11.454min），4-氨基苯乙烯酸（12.906min），苯并[b]硒酚-2-腈（13.510min），2-甲基氨甲基-1,3-二氧戊環(huán)（15.726min），(E)-2-氟-3-(4-N,N-二甲端芳氨基)-丙烯酸（16.987min），2-甲基-6-叔辛基酚（17.713min），棕櫚酸（18.400min），鹽酸吖啶橙（18.645min），2-甲胺甲基-1,3-二氧戊環(huán)（18.897min）和2-氨基丁烷（19.829min）。所鑒定出的化合物的含量分別是11.743%、9.856%、2.393%、2.505%、2.853%、2.980%、2.698%、2.428%、1.272%、2.465%、1.981%、0.590%和1.488%。

圖1 老鷹茶香氣物質(zhì)的色譜圖Fig.1 Chromatogram for aroma components of Hawk tea

圖2 老鷹茶香氣物質(zhì)的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass chromatogram for aroma components of Hawk tea

2.2 老鷹茶香氣成分的抗氧化效果

通過測定老鷹茶揮發(fā)性物質(zhì)提取物的羥基自由基和DPPH自由基清除能力可以判斷老鷹茶香氣物質(zhì)的抗氧化效果。通過圖3和圖4可以看出，0.5、1.0、2.0mg/mL三個(gè)濃度下，隨著濃度的升高，老鷹茶揮發(fā)性物質(zhì)提取物的羥基自由基和DPPH自由基清除能力均得到提高。香氣成分中含有的1-吲哚、丙烯酮已經(jīng)被證明與其他化合物發(fā)生反應(yīng)后能生成具有抗氧化和抗癌效果的有效物質(zhì)[13-14]，香氣成分包含的二氧戊環(huán)也是合成許多抗氧化物質(zhì)的重要基團(tuán)[15]，這些成分在一定條件下都能起到有效的抗氧化效果。同時(shí)，棕櫚酸作為一種功能性成分已經(jīng)被證明具有抗氧化效果[16]，這些物質(zhì)的存在使得老鷹茶香氣成分具有抗氧化效果。

圖3 老鷹茶香氣物質(zhì)的羥基自由基清除效果Fig. 3 Effects of aroma components of Hawk tea in hydroxyl radical (OH)radical scavenging activity

圖4 老鷹茶香氣物質(zhì)的DPPH自由基清除效果Fig. 4 Effects of aroma components of Hawk tea in DPPH radical scavenging activity

2.3 老鷹茶香氣成分的抗突變效果

MNNG作為一種在環(huán)境中廣泛存在的化學(xué)誘變劑和致癌劑，其引起的突變與腫瘤尤其是胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，通過體外抗突變實(shí)驗(yàn)可以從一定程度檢驗(yàn)老鷹茶的抗突變性和抗癌效果[17-18]。Ames等建立的MNNG誘導(dǎo)TA100鼠傷寒沙門桿菌回復(fù)突變試驗(yàn)作為最典型的突變實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)茶葉抗突變效果[19-20]。老鷹茶香氣成分提取物對MNNG誘導(dǎo)的TA100菌具有一定的抑制作用。由表1可知，提取物濃度為1.25和2.5mg/皿時(shí)抑制率分別為39.6%和63.3%，樣品對MNNG 致突變物的抗突變試驗(yàn)結(jié)果表明老鷹茶香氣成分具有對MNNG誘導(dǎo)TA100菌的體外抗突變作用。

表1 老鷹茶香氣成分在致突變物N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（MNNG，0.4μg/皿）誘導(dǎo)TAIO0菌株下抗突變效果Table 1 Inhibitory effects of aroma components of Hawk tea against MNNG·induced mutation (0.4μg/disc)of nutrient deficiency strain TA100 of Salmonella typhimurium

2.4 老鷹茶香氣成分的癌細(xì)胞體外增殖抑制效果

觀察體外癌細(xì)胞增值的變化情況可以從一定程度上判斷食品的抗癌功能性[21]。茶葉對人體最直接的作用部位包括胃和腸道，所以本研究選擇癌細(xì)胞中的一種胃癌細(xì)胞和一種結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由表2可知，老鷹茶香氣成分提取物對體外生長的AGS 胃癌細(xì)胞和HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察其體外增殖抑制效果。用MTT法觀察不同濃度提取物處理癌細(xì)胞后的OD值讀數(shù)可以看到各組細(xì)胞的OD值均發(fā)生明顯變化，高濃度提取物處理癌細(xì)胞后，AGS和HT-29細(xì)胞的OD值均低于低濃度處理時(shí)，通過計(jì)算可得出高濃度樣品處理時(shí)具有更高的體外癌細(xì)胞生長抑制率，可見老鷹茶香氣成分具有一定的體外抗癌效果。癸烷為基團(tuán)的一些化合物也具有抑制癌細(xì)胞生長的作用[22]，有研究也表明包含丙烯酮基團(tuán)的一些物質(zhì)也具有抗氧化效果[23]，可見老鷹茶中所包含的這些物質(zhì)也是合成其他一些功能性成分的重要部分，這些香氣成分在例如發(fā)酵的進(jìn)一步的深加工中可能轉(zhuǎn)化為一些其他的功能性成分，提高老鷹茶的品質(zhì)。

表2 老鷹茶香氣成分對AGS和HT- 29癌細(xì)胞的體外增值抑制效果Table 2 Growth inhibitory effect of aroma components of Hawk tea on AGS and HT-29 cancer cells

3 結(jié) 論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，老鷹茶香氣物質(zhì)中主要含有 13種成分, 分別是 7H-二苯并[b,g]咔唑，癸烷，1H-吲哚，丙烯酮，4-氨基苯乙烯酸，苯并[b]硒酚-2-腈，2-甲基氨甲基-1,3-二氧戊環(huán)，(E)-2-氟-3-(4-N,N-二甲端芳氨基)-丙烯酸，2-甲基-6-叔辛基酚，棕櫚酸，鹽酸吖啶橙，2-甲胺甲基-1,3-二氧戊環(huán)和2-氨基丁烷。同時(shí)通過體外實(shí)驗(yàn)證明老鷹茶香氣物質(zhì)具有體外抗氧化、抗突變和抗癌效果。香氣成分中的物質(zhì)使得老鷹茶的香氣也產(chǎn)生功能性作用，可以看出改進(jìn)飲茶方式或加強(qiáng)工業(yè)茶飲料的制作工藝，保留老鷹茶的香氣成分，可以進(jìn)一步加強(qiáng)老鷹茶的使用價(jià)值。

[1]李俊. 老鷹茶中黃酮成分抗炎免疫作用的研究[J]. 中國藥理通訊，2005 (3): 8-8.

[2]計(jì)紅芳，南海娟，張令文，等. 老鷹茶總黃酮的提取工藝及抗氧化活性研究[J]. 中國食品添加劑，2011 (2): 121-125.

[3]盧曉黎，雷鳴，周建華，等. 四川石棉老鷹茶資源現(xiàn)狀及開發(fā)[J]. 食品科學(xué)，2001, 22(11): 102-104.

[4]沈君子，葉明，舒阿慶，等. 老鷹茶（Litsea coreana Levl.var.lanuginosa）多酚類化合物的提取純化及EGCG含量測定[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2010, 36(3): 329-334.

[5]趙欣，邵林楠，鄭妍菲. 老鷹茶的抗突變和體外抗癌效果[J]. 食品工程，2008 (4): 29-31.

[6]代毅，須海榮. 采用SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)對龍井茶香氣成分的測定分析[J]. 茶葉，2008, 34(2): 85-88.

[7]苗愛清，李家賢，何玉媚. 印度阿薩姆親緣雜交種“秀紅”紅茶香氣化學(xué)組成研究[J]. 廣東茶葉，1998 (2): 12-16.

[8]陸寧，宛曉春，潘冬. 茉莉花茶香氣成分與品質(zhì)之間關(guān)系的初步研究[J]. 食品科學(xué)，2004, 25(6): 93-97.

[9]張瑩，鐘應(yīng)富，袁林穎，等. 永川秀芽茶特征香氣成分研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012, 26(6): 2046-2049.

[10]Kang HS, Chung HY, Jung, JH, et al. Antioxidant effect of Salvia miltiorrhiza[J]. Archives of Pharmacal Research, 1997, 20(5):496-500.

[11]Banerijee A, Dasgupta N, Bratati D. In vitro study of antioxidant activity of Syzygium cumini fruit[J]. Food Chemistry, 2005, 90(4):727-733.

[12]Zhao X, Kim SH, Qi YC, et a1. Effects of different kinds of salt in comutagenicity and growth of cancer cells[J]. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 2012, 41(1): 26-32.

[13]董肖椿，聞韌，鄭劍斌. 1-吲哚基取代β-咔啉生物堿及其衍生物的合成和初步抗腫瘤活性[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004, 39(4): 259-262.

[14]關(guān)麗萍，尹秀梅，全紅梅，等. 羥基查爾酮類衍生物的合成[J]. 有機(jī)化學(xué)，2004, 24(10): 1274-1277.

[15]李衛(wèi)林，羅秋燕，閆福林. 硅膠鍵合N-丙基氨基磺酸催化合成8-芳基-7,8-二氫-[1,3]二氧雜環(huán)戊烯并[4,5-g]苯并吡喃-6-酮類化合物[J]. 有機(jī)化學(xué)，2011, 31(8): 1282-1285.

[16]李林強(qiáng)，李建科. 華山松籽油的成分分析及其抗氧化的研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2003, 23(10): 1788-1791.

[17]余應(yīng)年，孫雪敏，馮朝暉，等. 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、DNA復(fù)制保真度與哺乳細(xì)胞非定標(biāo)性突變--致癌物誘發(fā)基因突變分子機(jī)制研究[J]. 中國病理生理雜志，2000, 16(10): 1028-1029.

[18]鄧大君，朱少俠，陳強(qiáng)，等. MNNG 誘發(fā)新生大鼠腺胃癌模型的建立及其在胃癌發(fā)病機(jī)制研究上的應(yīng)用[J]. 中華病理學(xué)雜志，1994, 23(5): 293-295.

[19]Khan JA, Jalal JA, Ioanndes C, et a1. Assessment of the antimutagenic effect of Doash tea extract fractions[J]. Toxicology and Industrial Health, 2012, 28(10): 867-875.

[20]Bhattacharya U, Mukhopadhyay S, Giri AK. Comparative antimutagenic and anticancer activity of three fractions of black tea polyphenols thearubigins[J]. Nutrition and Cancer, 2011, 63(7): 1122-1132.

[20]王剛，趙欣. 兩種白茶的抗突變和體外抗癌效果[J]. 食品科學(xué)，2009, 30(11): 243-245.

[21]熊小琴，沈久明，梁峰. 1-對甲苯磺酰基-3-羥基-1,5,8-三氮雜環(huán)癸烷的合成及抗腫瘤活性的初步研究[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用，2011,23(4): 466-469.

[22]洪裕閔. 雷丸抗氧化、熒光成分及揮發(fā)性成分之研究[D]. 臺中：東海大學(xué)，2001.