丁 潔， 張圣虎， 劉濟(jì)寧*， 周林軍， 陳國(guó)松， 石利利

(1.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇南京210042;2.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京210009)

近年來(lái)，類(lèi)雌激素活性物質(zhì)雙酚A(bisphenol A，BPA)、四溴雙酚 A(tetrabromobisphenol A，TBBA)及烷基酚類(lèi)化合物(如壬基酚(nonylphenol，NP)、辛基酚(4-tert-octylphenol，OP))作為典型的環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)引起了人們的廣泛關(guān)注。水體中痕量的此類(lèi)物質(zhì)也會(huì)嚴(yán)重危害水生生物的生殖系統(tǒng)和胚胎發(fā)育［1］，抑制雄魚(yú)精子的生成［2］并導(dǎo)致雄性的雌性化［3］。至今，已經(jīng)有很多學(xué)者調(diào)查研究了各地河流、湖泊等水體中此類(lèi)物質(zhì)的濃度水平及分布，結(jié)果表明多種環(huán)境水體中均能檢測(cè)出不同濃度的雙酚A、四溴雙酚 A 及烷基酚類(lèi)化合物［4－6］。由于此類(lèi)化合物是精細(xì)化工生產(chǎn)中的重要中間體，廣泛應(yīng)用于表面活性劑、橡膠和塑料的抗氧化劑等中。由于大量此類(lèi)物質(zhì)隨著生活污水及工業(yè)廢水排放，污水處理作為此類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境前的重要消減環(huán)節(jié)尤為關(guān)鍵，但是由于污水處理工藝對(duì)其去除效率較低，大量未被去除的此類(lèi)物質(zhì)隨出水排放進(jìn)入周?chē)h(huán)境，對(duì)水生生物和人體健康造成潛在的危害。因此，建立污水處理廠的水樣中此類(lèi)物質(zhì)的分析測(cè)定方法，是研究其在水環(huán)境中暴露水平的基礎(chǔ)。

目前，報(bào)道較多的關(guān)于此類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定方法有氣相色譜-質(zhì)譜法［7］、高效液相色譜法［8］、液相色譜-質(zhì)譜法［9］、毛細(xì)管電泳法［10，11］、單掃示波極譜法［12］等，涉及樣品包括環(huán)境水樣、土壤［13］、生物［14］、食物［15］等，但水樣中此類(lèi)物質(zhì)多組分同時(shí)檢測(cè)的方法較少。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是檢測(cè)環(huán)境樣品中此類(lèi)物質(zhì)含量的一種重要方法，其靈敏度高，選擇性和特異性好，能對(duì)低濃度的樣品進(jìn)行很好的定量分析檢測(cè)?；诖?，本研究采用反相液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析方法同時(shí)檢測(cè)了污水處理廠水樣中可能存在的雙酚A、四溴雙酚A及烷基酚類(lèi)化合物，建立了可用于污水處理廠水樣中類(lèi)激素酚類(lèi)活性物質(zhì)的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-Agilent Technologies 1290 Infinity，MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美國(guó)AB公司);ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm ×2.1 mm，3.5 μm)(美國(guó) Agilent公司);Oasis HLB固相萃取小柱(500 mg，6 mL);數(shù)顯往復(fù)震動(dòng)搖床(德國(guó)IKA公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司);Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司);AG-285電子天平(瑞士Mettler公司)。

雙酚A、四溴雙酚A、4-壬基酚、對(duì)特辛基酚、4-叔丁基苯酚、4-丁基苯酚、4-己基苯酚、2，4-二叔戊基苯酚，上述標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)J＆K公司，純度均大于97%;乙腈、甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司);氨水(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司);超純水為Milli-Q純水機(jī)出水。上述標(biāo)準(zhǔn)品均用甲醇配成為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4℃冰箱。

1.2 樣品處理

液液萃取:準(zhǔn)確量取經(jīng)0.45 μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾的水樣100 mL于200 mL分液漏斗中，用100 mL二氯甲烷/正己烷(4∶1，v/v)混合萃取劑分3次(40 mL、40 mL、20 mL)進(jìn)行萃取;每次振蕩萃取20 min，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干;用甲醇定容至2 mL，過(guò)0.22 μm 孔徑濾膜，HPLC-MS/MS 分析。

固相萃取:分別用5 mL甲醇、5 mL超純水活化Oasis HLB固相萃取小柱(500 mg，6 mL);準(zhǔn)確量取經(jīng)0.45 μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾的水樣100 mL，經(jīng)活化的固相萃取小柱萃取，上樣速度約為5 mL/min;上樣后用10 mL的超純水淋洗HLB小柱，并在負(fù)壓條件下抽真空30 min進(jìn)行干燥，用10 mL甲醇洗脫;洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈?，然后用甲?水(1∶1，v/v)定容至2 mL，渦旋振蕩 2～3 min，HPLCMS/MS分析。

1.3 儀器條件

1.3.1 質(zhì)譜條件

采用電噴霧(ESI)離子源、負(fù)電離模式、多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)掃描定量分析目標(biāo)污染物。氣簾氣(curtain gas，CUR)壓力為 206 851.8 Pa，噴霧氣(ion source gas 1，GS1)壓力為241 327.1 Pa，輔助加熱氣(ion source gas 2，GS2)壓力為 275 802.4 Pa，源溫度(temperature，TEM)為400℃，離子化電壓(ion spray voltage，IS)為 5 500 V，碰撞氣(collision gas，CAD)壓力為41 370.36 Pa。其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 分析8種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrometric conditions for the analysis of the eight target compounds

1.3.2 液相色譜條件

采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm ×2.1 mm，3.5 μm);0.02%(v/v)氨水溶液(A)和乙腈(B)為流動(dòng)相，柱溫40 ℃，進(jìn)樣5 μL;測(cè)定時(shí)采用的流動(dòng)相梯度見(jiàn)表2。

表2 8種目標(biāo)化合物測(cè)定時(shí)的洗脫梯度Table 2 Gradient elution program for the analysis of the eight test compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)特征，選擇ESI負(fù)電離模式。采用半自動(dòng)進(jìn)樣方式，以5 μL/min的流速將500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作儲(chǔ)備液分別注入離子源;在MRM模式下對(duì)每種化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析(Q1掃描)，得到每種化合物的分子離子峰;選取相應(yīng)母離子峰，對(duì)其子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(Q2掃描)，得到碎片離子信息;接著對(duì)目標(biāo)化合物二級(jí)質(zhì)譜的CE、DP、EP、CXP等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)化合物的分子離子與特征離子碎片的離子強(qiáng)度達(dá)到最大時(shí)為最優(yōu)條件(見(jiàn)表1)。

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

分別用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.02%(v/v)氨水溶液作為流動(dòng)相，對(duì)8種目標(biāo)化合物(0.1 mg/L)的分離效果進(jìn)行比較。使用甲醇-水時(shí)目標(biāo)峰出現(xiàn)不同程度的拖尾現(xiàn)象，且發(fā)生重疊，8種目標(biāo)化合物不能得到有效分離(見(jiàn)圖1a);使用其他兩種流動(dòng)相體系時(shí)8種目標(biāo)化合物均可在11 min之內(nèi)達(dá)到完全分離，且目標(biāo)峰峰形較好。但由于待測(cè)物質(zhì)結(jié)構(gòu)式中都含有酚羥基，具有弱酸性，調(diào)節(jié)流動(dòng)相中pH可抑制弱酸的離解從而改變目標(biāo)化合物的響應(yīng)。在乙腈-水的基礎(chǔ)上加入0.02%(v/v)的氨水(見(jiàn)圖1b)，提高了8種目標(biāo)化合物的響應(yīng)。因此，選擇乙腈-0.02%(v/v)氨水溶液作為分離8種目標(biāo)化合物的流動(dòng)相體系。

2.3 提取方法的選擇

水樣中酚類(lèi)化合物的富集方法主要有液液萃取、固相萃取等。液液萃取操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備要求低;相比液液萃取而言，固相萃取中有機(jī)溶劑用量少，且富集倍數(shù)高，便于自動(dòng)化。本文研究了這兩種方法對(duì)水樣中目標(biāo)物的提取效果。

2.3.1 液液萃取

影響液液萃取效率的主要因素是萃取溶劑的選擇。本文比較了在添加質(zhì)量濃度為20 μg/L時(shí)二氯甲烷、正己烷和不同比例的二氯甲烷/正己烷混合萃取溶劑對(duì)8種目標(biāo)化合物的回收率，結(jié)果見(jiàn)圖2。二氯甲烷/正己烷(4∶1，v/v)作為萃取劑時(shí)提取回收率最高，均在60%以上。

2.3.2 固相萃取

用Oasis HLB小柱(500 mg，6 mL)進(jìn)行固相萃取。為了優(yōu)化固相萃取的實(shí)驗(yàn)條件，我們比較了添加質(zhì)量濃度為20 μg/L時(shí)，常用洗脫溶劑甲醇和乙腈對(duì)8種目標(biāo)化合物的回收率，結(jié)果如圖3所示。甲醇作為洗脫溶劑時(shí)，提取回收率較高，均大于70%。

圖1 不同流動(dòng)相條件下8種目標(biāo)化合物的質(zhì)量色譜圖Fig.1 Mass chromatograms of the eight target compounds with different mobile phasesa.methanol/water;b.acetonitrile/0.02%(v/v)ammonium hydroxide.1.TBBA;2.BPA;3.4-tert-butylphenol;4.4-butylphenol;5.4-hexylphenol;6.OP;7.NP;8.2，4-di-tert-amylphenol.

由上述結(jié)果表明，在兩種提取方法最優(yōu)條件下，利用Oasis HLB小柱進(jìn)行目標(biāo)化合物的提取可以獲得更高的提取回收率，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇固相萃取作為提取方法。

2.4 線性范圍和檢出限

準(zhǔn)確吸取目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為 1、2、5、10、20、50、100 μg/L 的一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的液相色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析。連續(xù)3天對(duì)5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定(每天測(cè)定3次)，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x，μg/L)進(jìn)行線性回歸。各目標(biāo)物在1～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系顯著，結(jié)果如表3所示。

圖2 液液萃取中不同萃取溶劑對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率Fig.2 Extraction efficiencies of the eight target compounds by liquid liquid extration with different extraction solutions

圖3 固相萃取中不同洗脫溶劑對(duì)烷基酚的提取效率Fig.3 Extraction efficiencies of the eight target compounds by SPE with different elution solutions

2.5 方法的回收率和精密度

在不含目標(biāo)化合物的空白水樣中添加標(biāo)樣溶液，質(zhì)量濃度分別為 0.2、2、20 μg/L，按上述方法進(jìn)行前處理和色譜分析，采用外標(biāo)法定量，結(jié)果見(jiàn)表4。回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿足樣品分析要求。以10倍信噪比時(shí)可以檢測(cè)到的化合物質(zhì)量濃度作為目標(biāo)物的方法定量限，可以得到水中烷基酚方法 定量限為2.0～20 ng/L。

表3 8種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、判定系數(shù)(R2)、日內(nèi)及日間精密度Table 3 R egression equations，coefficients of determination(R2)，intra-and intra-day R SDs of the eight target compounds

表4 回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和方法定量限Table 4 R ecoveries，R SDs and method quantification limits(MQLs)

2.6 樣品測(cè)定

選取江蘇省某化工園區(qū)一家典型工業(yè)廢水處理廠作為研究對(duì)象，于2013年9月采集廠區(qū)的原水、曝氣池出水口、沉降池出水口及總排水口的水樣進(jìn)行分析。采集的水樣放置于1 L棕色玻璃瓶?jī)?nèi)，于當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值達(dá)到2.0±0.2，并用0.45 μm孔徑玻璃纖維膜過(guò)濾，然后按照上述方法進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 污水處理廠水樣中8種目標(biāo)化合物的測(cè)定Table 5 Determination of the eight target compounds in the water samples from a sewage treatment plant

結(jié)果表明，在4個(gè)采樣點(diǎn)的樣品中均檢測(cè)到對(duì)特辛基酚、4-壬基酚、雙酚 A、4-叔丁基苯酚和4-己基苯酚，其在污水處理廠總排水口水樣中的質(zhì)量濃度范圍為 11.9～3 015.3 ng/L，最終去除率為36.1%～96.5%。表6對(duì)比了文獻(xiàn)報(bào)道中污水處理廠出水中涉及的部分目標(biāo)化合物的含量，與國(guó)內(nèi)外其他污水處理廠得到的檢測(cè)結(jié)果相比，本文中測(cè)得的結(jié)果在其范圍之內(nèi)。

表6 文獻(xiàn)報(bào)道的壬基酚、辛基酚及雙酚A在國(guó)內(nèi)外一些污水處理廠出水中的含量Table 6 Contents of NP，OP and BPA from some sewage treatment plant effluents at home and abroad from references

3 結(jié)論

建立了污水處理廠水樣中雙酚A、四溴雙酚A及6種烷基酚類(lèi)化合物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用Oasis HLB固相萃取小柱和甲醇進(jìn)行洗脫的方法提取目標(biāo)物，提取效率均在70%以上，可用于實(shí)際樣品測(cè)定。用乙腈和0.02%(v/v)氨水溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫的方式，8種目標(biāo)物在11 min內(nèi)很好地分離，可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確積分。線性和添加回收試驗(yàn)結(jié)果表明，用上述方法測(cè)定污水處理廠水樣中雙酚A、四溴雙酚A及6種烷基酚類(lèi)化合物的含量較為準(zhǔn)確可靠，回收率高，精密度及定量限均可達(dá)到分析檢測(cè)要求。

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