李帥鵬， 郭春娜， 孟 蕾， 黃顯會*

(1.華南農業(yè)大學國家獸藥殘留基準實驗室，廣東廣州510642;2.河南省獸藥監(jiān)察所，河南鄭州450008)

頭孢洛寧(cefalonium)是美國先靈葆雅(Schering-Plough)制藥公司在英聯邦國家內開發(fā)的奶?？菽唐卺槍θ榉垦椎念A防性用藥，是全球3個指定的動物專用頭孢類抗生素之一，屬于第二代頭孢類抗生素［1］。頭孢洛寧對酸和β-內酰胺酶穩(wěn)定，殺菌力強，抗菌譜廣，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有效;尤其對引起奶牛乳房炎的大多數病原菌有效，主要用于細菌感染引起的奶牛乳房炎的防治［2－4］。目前該藥只在日本、新西蘭、澳大利亞、歐盟和英聯邦國家范圍內使用，美國、加拿大等市場未使用該藥，我國也未見進口或開發(fā)報道。

頭孢菌素類抗生素的過量使用具有毒副作用，主要體現在對腦神經、聽覺以及腎臟的損害［5］，對人體健康造成危害。因此，世界各國對動物源性食品中的頭孢洛寧殘留量均提出了限量要求，歐盟規(guī)定牛奶中頭孢洛寧的最高殘留限量(MRL)為10 μg/kg［6］，日本肯定列表規(guī)定牛組織和牛奶中頭孢洛寧的最高殘留限量均為 10 μg/kg［7］。

國外頭孢洛寧乳房注入劑(Cepravin Dry Cow 250 mg Intramammary suspension(Dry Cow))已上市使用多年，但有關牛奶中頭孢洛寧殘留檢測方法的報道較少，主要有微生物法［8］、酶聯免疫分析法［9，10］和高效液相色譜-串聯質譜法［11，12］。牛奶中頭孢洛寧的MRL為10 μg/kg，且牛奶中干擾基質較多，HPLC法不能滿足殘留檢測的要求。本研究采用高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)分析牛奶中頭孢洛寧殘留，并進行了方法學評價。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API 4000電噴霧-串聯四極桿質譜儀，配Analyst 4.1.5軟件(美國應用生物系統公司);Agilent 1200型液相色譜儀(美國安捷倫公司);B-260型恒溫水浴鍋(上海雅榮生化儀器設備有限公司);Milli-Q純水機(美國Millipore公司);Mach1.6 R冷凍型離心機(美國Thermo公司)。頭孢洛寧標準物質:產品編號32904，CAS號5575-21-3，由美國 Sigma公司提供;正己烷為國產分析純;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純(美國Fisher公司)。

1.2 溶液的配制

頭孢洛寧標準儲備液(500 mg/L):準確稱取頭孢洛寧標準物質5.00 mg，置于10 mL容量瓶中，用30%(v/v)乙腈水溶液溶解并定容至刻度，配成500 mg/L標準溶液，于4℃冰箱中避光保存。臨用前用甲醇-0.1%甲酸水溶液(3∶7，v/v)稀釋成頭孢洛寧系列標準工作液，現用現配。0.1%甲酸水溶液:取1 mL甲酸，置于1 000 mL容量瓶內，用超純水定容至刻度，超聲后使用。甲醇-0.1%甲酸水溶液(3∶7，v/v):取30 mL甲醇與70 mL 0.1%甲酸水混勻即得。

1.3 樣品前處理

準確稱取(1.00±0.01)g牛奶置于15 mL離心管中。加入5 mL乙腈，渦旋1 min，置于振蕩器上以 300 r/min振蕩10 min，在 4℃條件下，以9 000 r/min離心10 min。轉移上清液至10 mL試管中，在37℃水浴中氮氣吹干，加入1 mL甲醇-0.1%甲酸水溶液(3∶7，v/v)復溶，渦旋1 min，溶液轉移至2 mL離心管中，加入0.8 mL正己烷除脂，渦旋1 min，在4℃下15 000 r/min離心10 min，棄去正己烷，過0.22 μm有機相針式過濾器至2 mL棕色進樣瓶中，LC-MS/MS分析。

1.4 色譜-質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱:美國Penomenex Luna C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm);流動相:乙腈(A)，0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脫程序:0.0～0.5 min，10%B;0.5～1 min，10%B～95%B;1～4 min，95%B;4～4.5 min，95%B～10%B;4.5～10 min，10%B。流速:0.25 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:5 μL。

1.4.2 質譜條件

用多反應監(jiān)測(MRM)掃描模式;電噴霧離子源(ESI);正離子掃描;電噴霧電壓4 kV;離子源溫度600℃;輔助氣壓力35 kPa;霧化氣壓力55 kPa;氣簾氣壓力15 kPa。頭孢洛寧的MRM質譜檢測參數:選擇離子對 m/z 459.4/337.3，459.4/152.3，其中定量離子對為m/z 459.4/337.3;碰撞能量(CE)14 eV;去簇電壓(DP)70 V;碰撞室射出電壓(CXP)10 V，射入電壓(EP)10 V。

2 結果與討論

2.1 質譜參數的確定

頭孢洛寧標準溶液(1 mg/L)分別在正離子和負離子模式下全掃描，發(fā)現頭孢洛寧在正離子模式下的響應值更高。頭孢洛寧標準溶液(1 mg/L)在正離子模式下全掃描，得到［M+H］+(m/z 459.4)準分子離子峰。對m/z 459.4進行二級質譜全掃描，得到頭孢洛寧二級全掃描質譜圖(見圖1)。結合頭孢菌素質子化離子的一般斷裂規(guī)律［13］可知，頭孢洛寧的質譜行為較簡單，主要為R2斷裂(見圖2)得到的 m/z 123.4和337.3;C(6)-C(7)鍵及C(7)-C(8)鍵斷裂導致β-內酰胺環(huán)開環(huán)得到的m/z 152.3和309.3;而m/z 337.3進一步裂解又可得到m/z 152.3。其中m/z 337.3和152.3的強度相對較大，干擾較小，故選擇m/z 337.3作為定量離子，m/z 152.3為輔助定性離子。

圖1 頭孢洛寧的二級質譜圖Fig.1 MS/MS spectrum of cefalonium

圖2 頭孢洛寧的結構式Fig.2 Chemical structure of cefalonium

2.2 色譜條件的優(yōu)化

頭孢洛寧屬于β-內酰胺酶類抗生素，結構式中既有游離羧基，又帶有氨基，為兩性物質，極性?。?4］。所選色譜柱的填料應為直鏈烷烴鍵合的硅膠，其中最常見的為十八烷基鍵合硅膠(即C18)。研究對比了Phenomenex Luna C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)和 Waters C18(150 mm ×2.1 mm，5 μm)色譜柱。兩種色譜柱對頭孢洛寧均有良好的保留，頭孢洛寧均可得到優(yōu)異的峰形。綜合考慮，本文選擇Phenomenex Luna C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)色譜柱。為了改善峰形及提高分離度，增強目標物在反相色譜柱上的保留，經常在流動相溶液中添加甲酸、乙酸等酸性物質或者甲酸銨、乙酸銨等緩沖鹽。在水相中添加0.1%的甲酸［15］及對流動相條件的調整能使頭孢洛寧在色譜柱上較好的保留(保留時間在6.1 min左右)，響應值高，峰形優(yōu)良。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 樣品前處理方法的考察

有關牛奶中頭孢洛寧殘留檢測方法報道的文獻資料中，有的采用離心的方法預先除去脂肪［11］，有的采用乙腈沉淀蛋白［16］，有的添加pH 8.5磷酸鹽緩沖液稀釋牛奶［12］然后過固相萃取(SPE)柱凈化。文獻報道的樣品前處理方法中，大部分都包含了操作繁瑣的SPE凈化步驟，成本較高。國家標準方法［16］稱取5 g牛奶，最后定容至2 mL，濃縮了約2.5倍，SPE柱凈化后樣品足夠干凈。本方法稱取1 g牛奶，最后定容至1 mL，正己烷除脂后，采用空白基質匹配標準溶液法［17］進行校準，檢測結果顯示樣品同樣足夠干凈。而本試驗無需SPE柱凈化，成本較低，簡便易行，效率高，定量限為2 μg/kg，靈敏度更高。

2.3.2 提取液及濃縮條件的選擇

牛奶中蛋白質較多，本試驗比較了乙腈、甲醇和乙醇沉淀蛋白的效果，結果發(fā)現乙腈的沉淀效果更好，頭孢洛寧的回收率較高，在75%以上;甲醇和乙醇沉淀蛋白效果不如乙腈，且回收率也相對低些(約60%)，所以最后選用乙腈作為蛋白沉淀劑?？疾炝顺恋? g牛奶中蛋白質所需要的乙腈的體積，嘗試過4、5、6、8、10 mL。4 mL 時提取不充分，回收率約65%;5 mL時回收率為75%～85%;連續(xù)增加乙腈體積至10 mL，回收率幾乎沒有提高。為了節(jié)約試劑及提高方法的簡便性，最終確定采用5 mL乙腈進行提取。氮氣流吹干濃縮時考察了溫度分別為30、37、40℃時對頭孢洛寧的影響。結果表明30℃下濃縮效率低，單個樣品吹干所需時間為1.2 h，回收率為74%～80%;40℃下濃縮效率高，但頭孢洛寧有所降解，回收率只有58%～65%;在37℃時濃縮效率較高，單個樣品吹干所需時間為40 min，且頭孢洛寧降解不明顯，回收率為75%～87%。在濃縮吹干后，加入1 mL甲醇-0.1%甲酸水溶液(3∶7，v/v)復溶，加入正己烷進一步除去脂溶性雜質，低溫高速離心后過0.22 μm濾膜可保證樣品足夠干凈。

2.4 標準曲線和線性范圍

準確稱取1 g空白牛奶7份分別置于15 mL離心管中，按1.3節(jié)方法處理樣品，用所得空白基質液分別配制頭孢洛寧標準工作液(2、5、10、20、50、100、200 μg/L)，用HPLC-MS/MS進行檢測。每一水平設5個平行樣品同日檢測，連續(xù)測定5日。以頭孢洛寧峰面積平均值為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X，μg/L)繪制標準曲線，求得牛奶中頭孢洛寧的回歸方程Y=2 944.9X+2 227.5，相關系數r=0.999 6。

2.5 檢出限和定量限

準確稱取空白牛奶1 g，依次加入不同質量濃度(1、5、10、20、50 μg/L)的頭孢洛寧標準工作液 100 μL，渦旋混勻，使得樣品中頭孢洛寧的添加濃度分別為 0.1、0.5、1、2、5 μg/kg，按 1.3 節(jié)方法處理樣品。以S/N≥3確定檢出限(LOD)，以S/N≥10確定定量限(LOQ)。牛奶中頭孢洛寧的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為 2 μg/kg。

2.6 回收率和精密度的測定

回收率和精密度采用在空白牛奶中添加標準溶液的方法進行檢測。其MRM譜圖見圖3和圖4。根據殘留限量要求及歐盟對頭孢洛寧設置的MRL，在 LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL 4 個添加水平，1 g空白牛奶中分別添加20、50、100、200 μg/L 的頭孢洛寧標準工作液100 μL，即牛奶中添加濃度為2、5、10、20 μg/kg，旋渦混勻，按1.3節(jié)方法處理樣品，每一水平設5個平行樣品同日檢測，連續(xù)測定5日。求得空白牛奶中添加頭孢洛寧回收率的平均值(X)和標準差(SD)，同時計算日內和日間相對標準偏差。結果表明，頭孢洛寧在牛奶中的平均回收率介于78.5%～86.2%之間，日內相對標準偏差為1.5%～6.2%，日間相對準偏差為2.9%～5.6%(見表1)。

圖3 空白牛奶的MR M譜圖Fig.3 MR M chromatogram of a blank milk sample

圖4 空白牛奶添加2 μg/kg頭孢洛寧的MR M譜圖Fig.4 MR M chromatogram of a blank milk sample spiked with cefalonium at 2 μg/kg

2.7 穩(wěn)定性

取20份空白牛奶，添加MRL水平的頭孢洛寧標準溶液，按1.3節(jié)方法處理樣品，用HPLC-MS/MS進行檢測，記錄其峰面積;于室溫條件下放置24 h后重新檢測，比較兩次峰面積的變化。結果顯示，牛奶樣品中頭孢洛寧的峰面積變化在－3.35%～3.80%之間，說明樣品在室溫條件下放置24 h內，頭孢洛寧穩(wěn)定性良好。

表1 牛奶中頭孢洛寧的加標回收率及相對標準偏差(n=5)Table 1 R ecoveries and relative standard deviations(R SDs)of cefalonium spiked in milk(n=5)

2.8 基質效應的消除

樣品基質溶液對待測物的電噴霧離子化影響較大，可抑制或增強信號響應，導致檢測結果的準確度與精密度降低。本試驗通過在空白牛奶基質提取液中添加低、中、高3 個濃度即2、20、200 μg/L 的頭孢洛寧標準溶液，與純溶劑中的信號強度進行比較，牛奶基質峰面積與純溶劑的峰面積比值分別為64%～92%、75%～88%、80%～86%，說明牛奶基質對頭孢洛寧檢測有抑制效應。為消除樣品基質效應的影響，采用空白基質匹配標準溶液法進行校準。

2.9 抽樣檢測

從不同市場購買新鮮牛奶10份，從超市購買國產蒙牛、伊利品牌盒裝牛奶各10份，以及新西蘭、澳大利亞進口盒裝牛奶各10份，每份100 mL，共50份樣品，按本方法進行樣品前處理和檢測。結果顯示，所有國產樣品均未檢測出頭孢洛寧殘留，有1份新西蘭進口樣品檢測出8.0 μg/kg頭孢洛寧殘留。這是因為頭孢洛寧在國內尚未批準使用，有關頭孢洛寧防治奶牛乳房炎的制劑還處于研發(fā)階段，尚未投入生產。上述結果表明該方法可用于檢測牛奶中頭孢洛寧的殘留量。

3 結論

本文建立了HPLC-MS/MS測定牛奶中頭孢洛寧殘留量的分析方法。樣品經乙腈提取，氮氣吹干后用甲醇-0.1%甲酸水溶液(3∶7，v/v)復溶，正己烷去除脂肪后，經HPLC-MS/MS分析。本方法前處理操作簡便易行，不需要SPE柱凈化，所需試劑較少，成本較低，且精密度和重復性好，靈敏度高，定量限低于歐盟對牛奶中頭孢洛寧制定的最高殘留限量，適用于牛奶中頭孢洛寧的殘留檢測。

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