竇阿波， 鄒存杰， 單圓鴻， 石先哲*， 許國旺

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.遼寧對外經(jīng)貿(mào)學(xué)院，遼寧大連116052)

近期發(fā)展起來的毛細(xì)管高效液相色譜(μ-HPLC)［1，2］是一種高效的分析方法，克服了常規(guī)高效液相色譜(HPLC)存在分離效能低，樣品、流動(dòng)相和固定相消耗大等缺點(diǎn)。對于較為稀缺的生物樣品，使用μ-HPLC分析極為有利，這種方法也對環(huán)境更友好。因此其在手性分離、蛋白質(zhì)及多肽分析等眾多研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。μ-HPLC的關(guān)鍵是發(fā)展分離性能優(yōu)良的毛細(xì)管色譜柱。近年來，毛細(xì)管色譜柱中發(fā)展最快的就是整體柱(monolithic column)，其是一種利用有機(jī)、無機(jī)聚合或者有機(jī)-無機(jī)雜化的方法在毛細(xì)管空柱內(nèi)形成的連續(xù)床固定相色譜柱，具有優(yōu)異的通透性，制備簡單，分離柱壓低［3－5］。隨著近來功能化聚合物單體的發(fā)展，開始出現(xiàn)很多新型分離模式的毛細(xì)管色譜柱［6－8］，如混合模式色譜柱等，具有極好的發(fā)展前景。

混合模式色譜(mixed-mode chromatography，MMC)指的是同時(shí)應(yīng)用多種作用力進(jìn)行保留和分離的色譜方法［9－11］。帶正、負(fù)電及非極性的物質(zhì)可用離子交換和反相色譜的混合模式色譜柱同時(shí)分離［12，13］，故可以一根混合模式的色譜柱代替多根單模式的色譜柱，而且通過改變流動(dòng)相條件在封閉體系中完成二維或多維的分析［9］，具有與相應(yīng)多種單模式色譜填料相當(dāng)或更好的分離效率。

本研究使用［2-(甲基丙烯?；趸?乙基］二甲基-(3-磺酸丙基)氫氧化銨(SPE)與乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)在100 μm內(nèi)徑的石英玻璃毛細(xì)管內(nèi)原位聚合制備具有優(yōu)良通透性能的毛細(xì)管液相色譜整體柱(SPE-co-EDMA)，詳細(xì)考察了致孔劑的種類及與單體的配比、引發(fā)劑用量、聚合反應(yīng)的溫度、時(shí)間等因素對毛細(xì)管整體柱的通透性、孔徑分布、柱效等性能的影響，同時(shí)在μ-HPLC操作模式下進(jìn)行了色譜性能評價(jià)，取得了較理想的效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

毛細(xì)管電泳儀(MDQ，Beckman Coulter，美國)，納升液相色譜儀(LC-20AD nano，Shimadzu，日本);精密 pH 計(jì)(FE-20，Mettler Toledo，瑞士)，超聲波清洗儀(SB-50D，寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司，中國)，氣相色譜儀(HP9790，浙江福立分析儀器有限公司，中國)，掃描電子顯微鏡(JSM-6360LV，JEOL，日本)。

熔融石英毛細(xì)管(100 μm i.d.，河北永年銳澤色譜器件有限公司，中國);γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)、SPE和EDMA購自Sigma-Aldrich(美國);偶氮二異丁腈(AIBN，上海試四赫維化工有限公司，中國);正丙醇、1，4-丁二醇均為分析純(天津科密歐化學(xué)試劑公司，中國);NaOH、HCl、二氯甲烷均為分析純(中國國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，中國);甲醇和乙腈(色譜純，Merck，美國);實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，美國)提供;流動(dòng)相使用前超聲脫氣20 min。

1.2 毛細(xì)管整體柱的制備

1.2.1 毛細(xì)管的預(yù)處理

截取2 m長、內(nèi)徑100 μm的毛細(xì)管空柱，根據(jù)文獻(xiàn)［14，15］的方法對其進(jìn)行處理:先用 0.1 mol/L NaOH沖洗2 h，然后用超純水沖洗至出口溶液pH中性，再用0.1 mol/L HCl沖洗0.5 h，然后用超純水沖洗至出口溶液pH中性，再用甲醇沖洗1 h，置于氣相色譜儀柱溫箱中，60℃下用N2吹3 h，干燥。將10 mL γ-MAPS 與甲醇的混合溶液(1∶1，v/v)注入上述處理好的毛細(xì)管內(nèi)，并將毛細(xì)管兩端用橡膠塞封口，置于45℃反應(yīng)16 h，然后用甲醇溶液沖洗1 h，40℃下用N2吹掃3 h，干燥。使毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合一層帶烯基的硅烷化物質(zhì)，兩端封口備用。

1.2.2 整體柱的制備

將 400 μL 正丁醇、200 μL 1，4-丁二醇和 100 μL 水以及 200 μL EDMA(密度 1.051 g/mL，25℃)、200 mg SPE和4 mg AIBN混合均勻，超聲振蕩5 min后，將反應(yīng)液注入已經(jīng)預(yù)處理過的長度為50 cm的空毛細(xì)管中，控制吸入液的長度約25 cm(用于毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn))或者灌滿已經(jīng)預(yù)處理過的長度為30 cm毛細(xì)管(用于液相色譜實(shí)驗(yàn))，將毛細(xì)管的兩端用橡膠塞封口，置于氣相色譜儀柱溫箱中，按圖1反應(yīng)原理于60℃反應(yīng)12 h。反應(yīng)完成后，以甲醇為流動(dòng)相，用液相色譜泵沖洗毛細(xì)管柱約4 h，然后注入純乙腈，保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 反應(yīng)原理示意圖Fig.1 Scheme of reaction principle

1.3 毛細(xì)管柱色譜參數(shù)及色譜條件

毛細(xì)管整體柱的機(jī)械強(qiáng)度及重復(fù)性的評價(jià)在納升液相色譜儀上進(jìn)行，流動(dòng)相為乙腈-水(95∶5，v/v)，流速為400 nL/min，紫外檢測波長為224 nm。

毛細(xì)管整體柱性能評價(jià)使用毛細(xì)管電泳儀壓力模式，流動(dòng)相為不同配比的乙腈與10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 2.00)，分離壓力為6.2×105Pa，進(jìn)樣壓力和時(shí)間分別為6.9×104Pa和10 s。毛細(xì)管整體柱柱長為21 cm，出口端和檢測窗口的距離為10.2 cm，紫外檢測波長為214 nm。

2 結(jié)果與討論

致孔劑的種類及與單體的配比、引發(fā)劑用量、聚合反應(yīng)的溫度、時(shí)間等多種因素都會(huì)影響聚合物整體柱床層及內(nèi)部孔結(jié)構(gòu)。

2.1 致孔劑和反應(yīng)物種類、配比的優(yōu)化

甲醇、正丙醇、正丁醇、1，4-丁二醇和水以及EDMA、SPE和AIBN按表1的比例混合均勻后反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只用甲醇作為致孔劑時(shí)聚合物床層十分致密，孔徑小，通透性很差;用甲醇-正丙醇、甲醇-正丁醇時(shí)孔徑有所增大，通透性明顯改善，但柱效不高?？紤]到SPE帶有陽離子，嘗試了極性稍強(qiáng)的正丁醇、1，4-丁二醇和水的三元體系混合致孔劑，發(fā)現(xiàn)所制備的毛細(xì)管整體柱不僅通透性好，而且樣品分離效果好，理論塔板數(shù)可達(dá)5×104m－1以上。因此最后選定正丁醇、1，4-丁二醇和水(4∶2∶1，v/v/v)為致孔劑。此外，通過優(yōu)化降低交聯(lián)劑EDMA的比例，克服了毛細(xì)管整體柱彎曲時(shí)可能發(fā)生脆裂的現(xiàn)象，最終選擇單體和交聯(lián)劑質(zhì)量比為49∶51。

在優(yōu)化條件下制備整體柱，利用甲苯測得的死時(shí)間計(jì)算其滲透性(permeability，K):

其中u按以下公式計(jì)算:

式中 u、η、Fm、ΔP、L 和 r分別表示流動(dòng)相的線速度、黏度、流速、毛細(xì)管實(shí)際柱壓、柱長度和柱半徑，具體數(shù)據(jù)為Fm=400 nL/min，η =0.35×10－3Pa·s(純乙腈，25℃)，L=0.16 m，ΔP=2.2×106Pa。計(jì)算得到 K=2.17 ×10－14m2。

表1 SPE-co-EDMA聚合物整體柱的原料配比Table 1 Composition of the SPE-co-EDMA polymer monolithic columns

2.2 引發(fā)劑的用量

引發(fā)劑的用量影響聚合物反應(yīng)的速度和孔徑的大小。引發(fā)劑的用量過少(AIBN少于0.15 mg)時(shí)，聚合速度很慢，反應(yīng)幾乎不能進(jìn)行;AIBN為1 mg時(shí)，聚合反應(yīng)12 h后仍未進(jìn)行完全;而引發(fā)劑用量過大，單體聚合速度快，最后形成的聚合物顆粒相對較小，聚合物孔徑變小，通透性變差。經(jīng)過優(yōu)化，在實(shí)驗(yàn)中用4 mg AIBN引發(fā)聚合反應(yīng)。

2.3 反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)時(shí)間對聚合物的骨架結(jié)構(gòu)和孔徑大小有重要影響，考察了反應(yīng)時(shí)間為1、6、12、24 h時(shí)的聚合物性質(zhì)。結(jié)果表明，1 h和6 h的反應(yīng)不完全，聚合物骨架沒有生成;12 h時(shí)聚合物反應(yīng)完全，床層結(jié)構(gòu)較好，孔徑分布均勻;24 h時(shí)的聚合物性質(zhì)與12 h的聚合物差別不大，因此選擇反應(yīng)時(shí)間為12 h。

2.4 反應(yīng)溫度

控制反應(yīng)溫度可以有效地控制聚合反應(yīng)的進(jìn)度。實(shí)驗(yàn)表明，反應(yīng)溫度為50℃時(shí)，時(shí)間長達(dá)24 h時(shí)聚合反應(yīng)仍不發(fā)生;反應(yīng)溫度為60℃時(shí)，反應(yīng)12 h可生成均勻的床層;反應(yīng)溫度為70℃時(shí)，反應(yīng)12 h所得聚合物結(jié)構(gòu)致密，通透性不好，因此選擇反應(yīng)溫度為60℃。

2.5 毛細(xì)管整體柱性能評價(jià)

2.5.1 毛細(xì)管整體柱的表征

圖2為SPE與EDMA在γ-MAPS預(yù)處理過的毛細(xì)管內(nèi)聚合后橫切面的掃描電鏡圖，可以清楚地看到經(jīng)硅烷化處理的毛細(xì)管內(nèi)壁與SPE-co-EDMA聚合物牢牢地結(jié)合在一起。聚合物孔徑大小分布均勻，通透性較好。

2.5.2 毛細(xì)管整體柱的機(jī)械強(qiáng)度

分別在乙腈和純水的條件下做了流速和壓力的關(guān)系曲線，如圖3所示，得到非常好的線性關(guān)系，表明該整體柱在10 MPa內(nèi)具有良好的機(jī)械強(qiáng)度。

圖2 SPE-co-EDMA毛細(xì)管整體柱截面的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy(SEM)images of poly(SPE-co-EDMA)capillary monolithic column

2.5.3 毛細(xì)管整體柱的重復(fù)性

在優(yōu)化后的條件下合成了3批毛細(xì)管整體柱，每批3根，并在相同的液相色譜條件下考察其重復(fù)性。同一批次峰面積的柱間重復(fù)性(RSD)為1.0%;同一根柱峰面積的日間重復(fù)性(RSD)為1.2%;不同批次柱峰面積的重復(fù)性(RSD)為4.6%;可以看出所制備的毛細(xì)管整體柱的重復(fù)性良好。

2.5.4 色譜行為的考察及應(yīng)用

圖3 毛細(xì)管整體柱在乙腈和水中的柱壓-流速曲線Fig.3 Curves of pressure versus flow rate in ACN and water of capillary monolithic column

圖4 不同流動(dòng)相下SPE-co-EDMA整體柱分離甲苯、硫脲、丙烯酰胺的色譜保留行為Fig.4 Chromatographic behaviors of acrylamide，thiourea and toluene on the SPE-co-EDMA monolithic column with different mobile phasesMobile phases:a.40%CH3CN+10 mmol/L phosphate(pH 2.00);b.57%CH3CN+10 mmol/L phosphate(pH 2.00);c.94%CH3CN+10 mmol/L phosphate(pH 2.00).Peaks:1.acrylamide;2.thiourea;3.toluene.

如圖4所示，我們對甲苯、硫脲、丙烯酰胺3種化合物在SPE-co-EDMA聚合物整體柱上的保留行為進(jìn)行了研究。流動(dòng)相中乙腈含量不同，3種物質(zhì)的出峰順序也不同。乙腈含量較低時(shí)(40%)，硫脲比甲苯先出峰;隨著乙腈含量的不斷升高，硫脲的保留時(shí)間逐漸增長，甲苯保留時(shí)間逐漸縮短;乙腈含量較高時(shí)(94%)，甲苯最先出峰，硫脲最后出峰。這說明該毛細(xì)管整體柱是一種混合模式的整體柱，在乙腈含量較高時(shí)表現(xiàn)為親水作用模式，在乙腈含量較低時(shí)又表現(xiàn)為反相色譜柱的特征［16］。

用5種混合標(biāo)準(zhǔn)品(甲苯、丙烯酰胺、胸腺嘧啶、尿嘧啶和硫脲)溶液對制備的毛細(xì)管整體柱進(jìn)行了測試，得到很好的基線分離(見圖5)。

圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在SPE-co-EDMA整體柱上的分離色譜圖Fig.5 Chromatogram of a mixed solution of standards on the SPE-co-EDMA monolithic columnMobile phase:94% CH3CN+10 mmol/L phosphate(pH 2.00);UV:214 nm.Peaks:1.toluene;2.acrylamide;3.thymine;4.uracil;5.thiourea.

3 結(jié)論

本文制備了一種混合模式的SPE-co-EDMA毛細(xì)管整體柱。對反應(yīng)物的配比、致孔劑的種類、引發(fā)劑用量、聚合反應(yīng)溫度及時(shí)間等制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，使整體柱具有非常獨(dú)特的分離特性，在乙腈含量較高時(shí)表現(xiàn)為親水作用，在乙腈含量較低時(shí)表現(xiàn)為反相色譜分離模式。而且制備的整體柱具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、滲透性和重復(fù)性，可在單根色譜柱上進(jìn)行極性、非極性化合物的分離分析。此混合模式整體柱在單柱二維液相色譜方面將有很好的應(yīng)用前景。

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