陳永鋒+王海晶+劉丁瑗+周向東

[摘要] 目的 探討小分子NEK2干擾RNA（siRNA-NEK2）逆轉(zhuǎn)人肺癌耐藥細(xì)胞（A549/DDP）耐藥性的研究。 方法 應(yīng)用Real-time PCR法及Western blot法驗(yàn)證NEK2基因在人肺腺癌耐藥細(xì)胞系（A549/DDP）細(xì)胞系呈現(xiàn)高表達(dá)；并采用脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，將NEK2小片段RNA導(dǎo)入A549/DDP細(xì)胞沉默NEK2基因；應(yīng)用MTT法觀察順鉑、阿霉素對(duì)沉默NEK2基因后的A549/DDP細(xì)胞的細(xì)胞毒活性變化。 結(jié)果 NEK2-mRNA、NEK2蛋白在A549/DDP細(xì)胞系表達(dá)水平均顯著高于A549細(xì)胞系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；順鉑、阿霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別是（53.08±0.56）、（8.09±0.31）μg/mL，對(duì)siRNA-control A549/DDP細(xì)胞的IC50分別是（53.09±0.78）、（8.10±0.98）μg/mL，而對(duì)siRNA-NEK2 A549/DDP細(xì)胞的IC50有顯著下降，其值分別是（18.59±0.10）、（2.30±0.14）μg/mL，兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 小分子NEK2干擾RNA沉默NEK2可以提高耐藥的肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。NEK2可能成為逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 肺癌；細(xì)胞耐藥；NEK2；siRNA-NEK2

[中圖分類號(hào)] R563.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）02（b）-0017-04

Study of drug-resistant effect on lung cancer cells with siRNA-NEK2 silencing

CHEN Yongfeng1，2 WANG Haijing1 LIU Dingyuan1 ZHOU Xiangdong1

1.Department of Respiratory， Southwest Hospital of the Third Military Medical University， Chongqing 400038， China； 2.Department of Reception， the 75600 Army Hospital of PLA， Guangdong Province， Shenzhen 518048， China

[Abstract] Objective To investigate the drug-resistant effect of siRNA-NEK2 on lung cancer cells lines A549/DDP. Methods Expression of NEK2-mRNA and NEK2-protein was examined in human A549 cells and A549/DDP cells by Real-time PCR and Western blot. The changes of cytotoxic activity were observed on the A549/DDP cells of silence NEK2 by MTT assay. Results The expression of NEK2-mRNA and NEK2 protein were higher in A549/DDP cells than A549 cells （P < 0.05）. After treatment with DDP and Epirubicin， the IC50 values of A549/DDP cells were （53.08±0.56） and （8.09±0.31） μg/mL respectively， and the IC50 values of siRNA-control A549/DDP cells were （53.09±0.78） and （8.10±0.98） μg/mL respectively. While the IC50 values were significantly decreased in siRNA-NEK2 A549/DDP cells [（18.59±0.10）， （2.30±0.14） μg/mL]， two groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Silence NEK2 with interfering RNA molecule can reduce the resistance of lung cancer cells with resistant and may increase the sensitivity of chemotherapy-resistant lung cancer patients. Therefore， NEK2 may be a new target that reverses the drug resistance of lung cancer.

[Key words] Lung cancer； Drug resistance； NEK2； siRNA-NEK2

肺癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康，已成為世界上死亡率第一位的惡性腫瘤。約80%的患者就診時(shí)已屬晚期，化療成為其主要治療手段，而肺癌耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生是影響化療效果的重要原因。已有研究表明，腫瘤細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制極其復(fù)雜，除了進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度減少外，DNA斷裂修復(fù)加速、靶基因突變、擴(kuò)增、以及凋亡抑制蛋白的表達(dá)差異等均會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥[1]。因此，逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥的發(fā)生，已經(jīng)成為肺癌治療研究中的熱點(diǎn)。NEK2（NIMA-related kinase 2，NEK2）是一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的NIMA相關(guān)激酶，屬于中心體相關(guān)蛋白激酶[2]。NEK2及其同系物過表達(dá)可以聚集中心體而過快推進(jìn)有絲分裂進(jìn)程甚至直接觸發(fā)染色質(zhì)的分裂[3]。近年來的研究已發(fā)現(xiàn)，NEK2廣泛高表達(dá)于多種腫瘤，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[4]；NEK2基因的過表達(dá)可顯著增強(qiáng)將化療藥物泵出細(xì)胞外的蛋白質(zhì)的活性，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生[5]。本研究擬從沉默NEK2基因入手，探討耐藥的肺癌細(xì)胞沉默NEK2基因后，化療藥物敏感性的變化，為臨床肺癌化療耐藥逆轉(zhuǎn)，提高化療療效尋找新的靶點(diǎn)和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與細(xì)胞系

人肺腺癌敏感細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和耐順鉑（DDP）人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP細(xì)胞，均購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸病研究所。順鉑、阿霉素（江蘇豪森藥業(yè)有限公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Binder，德國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（Bio-Rad，美國(guó)），RNAiso plus kit、PrimeScriptR RT reagent kit、LipofectamineTM RNAiMAX（Invitrogen，美國(guó)），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Boehringer Mannheim，德國(guó)），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Takara，大連），RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT、DMSO、TBST緩沖液、胎牛血清（FCS）（GIBCO BRL，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2、達(dá)到飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天以0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。A549/DDP細(xì)胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行復(fù)蘇，培養(yǎng)2～3 d后待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用半量順鉑培養(yǎng)液（順鉑濃度：0.5 μg/mL）培養(yǎng)1夜，再以全量順鉑培養(yǎng)液（順鉑濃度：1 μg/mL）培養(yǎng)1夜，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.3 RNA的提取與RT-PCR

采用RNAiso plus kit試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒要求操作。NEK2上游引物序列：5'-CCACAGACGAAGTGATGGTG-3'，下游引物序列：5'-TGATTTTCCCAGCGAGTTCT-3'，檢測(cè)按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。定量PCR采用的體系為：dNTPs 2 μL，10×buffer 5 μL，上下游引物各10 pmol，Pfu酶0.5 μL，模板2 μL，加三蒸水至總體積50 μL；擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃ 5 min，進(jìn)入循環(huán)，變性94℃ 1 min，退火60℃ 1 min，延伸72℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參，依據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算各組細(xì)胞mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot法

將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后離心棄上清，加入含全酶抑制劑和苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液冰浴裂解提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，冰浴進(jìn)行電泳，電泳分離后用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加抗人NEK2多克隆抗體4℃孵育過夜，次日PBS 1次、TBST 2次洗膜后加入辣根酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。洗膜后ECL發(fā)光，X線片顯影、定影、掃描儀掃描膠片。

1.5 NEK2基因siRNA序列的設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染

siRNA片段由上海生工合成。靶向NEK2的siRNA序列為5'-CCAAGGAAAGGCAAUACUUUUdTdT-3'（sense）和5'-AAGUAUUGCCUUUCCUUGGUUdTdT-3'（antisense）。制備終濃度為80 nmol/L的siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)組加入siRNA-NEK2混合物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。將人耐藥肺腺癌細(xì)胞A549/DDP以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基，采用LipofetamineTM 2000將siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.6 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)順鉑對(duì)沉默NEK2后A549/DDP細(xì)胞增殖活性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分為4組即：A549細(xì)胞組（記為A549組）、A549/DDP組、A549/DDP轉(zhuǎn)染Silencer Negative Control siRNA組（記為siRNA-Control A549/DDP組）及A549/DDP轉(zhuǎn)染siRNA-NEK2組（記為siRNA-NEK2 A549/DDP組）。細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的含藥培養(yǎng)基200 μL，每組濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不含細(xì)胞僅有培養(yǎng)基的空白組和含細(xì)胞不加藥物的陰性對(duì)照組。加藥完畢放入培養(yǎng)箱孵育24 h。取出培養(yǎng)板，每孔加20 μL MTT，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄上清，每孔加入150 μLDMSO，震蕩10 min使紫色結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各孔A值，記錄結(jié)果。計(jì)算各給藥濃度的抑制率，用SPSS 16.0求各藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）]×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NEK2在A549細(xì)胞與A549/DDP細(xì)胞系中的表達(dá)

采用RT-PCR方法分析比較NEK2-mRNA在A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞系的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1A顯示，NEK2-mRNA在A549/DDP細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于A549細(xì)胞系。證明NEK2-mRNA在人耐藥非小細(xì)胞肺癌A549/DDP細(xì)胞系中呈現(xiàn)出高表達(dá)，提示肺癌耐藥性與NEK2的表達(dá)差異性有關(guān)。采用Western blotting方法比較NEK2蛋白在A549細(xì)胞及A549/DDP的差異表達(dá)。結(jié)果如圖1B所示，NEK2蛋白在A549/DDP中的表達(dá)水平明顯高于A549細(xì)胞，與基因水平結(jié)果一致，提示NEK2蛋白高表達(dá)與肺癌細(xì)胞的耐藥有關(guān)。

與A549比較，*P < 0.05

圖1 NEK2在A549及A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.2 siRNA-NEK2沉默效果鑒定

采用RT-PCR及Western blot檢測(cè)siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后的沉默效果。siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞24、48 h后，與對(duì)照組相比，NEK2 mNRA及蛋白表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

與對(duì)照組比較，*P < 0.05

圖2 siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染效果圖

2.3 順鉑及阿霉素對(duì)沉默NEK2后A549/DDP細(xì)胞增殖活性的影響

采用脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，將NEK2小片段RNA導(dǎo)入A549/DDP細(xì)胞沉默NEK2基因，并用MTT法檢測(cè)順鉑及阿霉素對(duì)A549以及沉默NEK2前后A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制活性。沉默NEK2基因后，順鉑及阿霉素對(duì)siRNA-NEK2 A549/DDP組的增殖抑制活性較A549/DDP組、siRNA-control A549/DDP組明顯增加，IC50明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。說明沉默NEK2可以增加化療藥物對(duì)肺癌細(xì)胞的敏感性。見圖3、表1。

圖3 順鉑及阿霉素對(duì)細(xì)胞的增殖抑制曲線

表1 順鉑及阿霉素對(duì)細(xì)胞半數(shù)抑制濃度影響（μg/mL，x±s）

注：與siRNA-NEK2 A549/DDP組比較，*P < 0.05

3 討論

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是化療藥物在臨床應(yīng)用時(shí)的常見阻礙，它會(huì)導(dǎo)致化療的失敗，與患者治療效果不佳有關(guān)，包括癌癥的復(fù)發(fā)和患者的死亡[6]。因此，研究耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制并尋找應(yīng)對(duì)方法，是提高化療藥物臨床有效性的迫切需要。NEK2屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶，集中于染色體著絲，粒通過底物磷酸化調(diào)節(jié)紡錘體的形成和分離，影響細(xì)胞有絲分裂從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖[7]。研究發(fā)現(xiàn)，NEK2基因與增加癌癥抗藥性、加速癌癥生長(zhǎng)以及患者死亡率上升存在很強(qiáng)的相關(guān)性。在2500例患者中，NEK2基因表達(dá)的增加均與患者的快速死亡有關(guān)[5]。對(duì)乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞耐藥機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，NEK2干擾siRNA可以改善癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[8]。本研究經(jīng)RT-PCR法及Western blot法證明了耐藥的肺癌細(xì)胞A549/DDP細(xì)胞NEK2-mRNA、NEK2蛋白表達(dá)水平顯著高于A549細(xì)胞，說明NEK2與肺癌細(xì)胞耐藥有關(guān)。

前期研究發(fā)現(xiàn)耐藥的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549高表達(dá)NEK2，本研究采用siRNA抑制細(xì)胞表達(dá)NEK2，觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)變化。研究通過MTT法發(fā)現(xiàn)抑制NEK2表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，推測(cè)與NEK2的微管調(diào)控作用相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，NEK2與腫瘤細(xì)胞中染色質(zhì)不穩(wěn)定性相關(guān)[9]。在細(xì)胞有絲分裂過程中，染色質(zhì)的分離是一個(gè)依賴于微管活動(dòng)的復(fù)雜過程，微管形成紡錘體后，引起細(xì)胞分裂。NEK2在中心體的定位依賴于其C端調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的有絲分裂，此定位也是微管結(jié)合所必需的[10]。抑制NEK2能阻礙中心體的成熟和紡錘體相關(guān)蛋白的招募[11]；所以總的來說，NEK2不僅是中心體分裂間期一個(gè)關(guān)鍵的組件，而且還是中心體自身裝配及檢修所必需的。研究表明，沉默NEK2后，TNBC細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性增加，并且使TNBC細(xì)胞凋亡增加，可能是由于有絲分裂的異常[12]。

本研究通過小分子NEK2干擾RNA，并經(jīng)MTT法觀察順鉑、阿霉素對(duì)沉默NEK2后A549/DDP細(xì)胞增殖抑制活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑及阿霉素對(duì)siRNA-NEK2 A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制活性與對(duì)照組（A549/DDP、siRNA-control A549/DDP）相比明顯增加，IC50明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯增加，說明沉默NEK2可以提高耐藥肺癌細(xì)胞A549/DDP對(duì)相關(guān)化療藥物的敏感性，使得肺癌細(xì)胞耐藥得到逆轉(zhuǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌的耐藥性和抗凋亡因子NEK2的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)；小分子NEK2干擾RNA沉默NEK2基因能夠提高耐藥肺癌細(xì)胞對(duì)相關(guān)化療藥物的敏感性，肺癌細(xì)胞耐藥得以逆轉(zhuǎn)；NEK2可以成為逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥的一個(gè)新靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2013-09-06 本文編輯：李繼翔）

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（收稿日期：2013-09-06 本文編輯：李繼翔）