李芳林 張凝宇 欽卓輝 李 輝 李智民

（深圳市職業(yè)病防治院，廣東 深圳 518000）

血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑減輕糖尿病腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)

李芳林 張凝宇 欽卓輝 李 輝 李智民

（深圳市職業(yè)病防治院，廣東 深圳 518000）

目的 探討血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對(duì)糖尿病腎臟的保護(hù)作用。方法 STZ尾靜脈注射建立大鼠糖尿病模型。用免疫組化方法檢測(cè)大鼠腎臟巨噬細(xì)胞的表達(dá)。比較血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療組與非治療組腎臟巨噬細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果 糖尿病成模后，巨噬細(xì)胞在腎間質(zhì)的表達(dá)明顯增加。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療組較非治療組腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)減少加(P＜0.01)，伴隨蛋白尿的減輕。結(jié)論 血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可減輕糖尿病大鼠腎臟炎癥浸潤(rùn)。

血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑；巨噬細(xì)胞；糖尿病

越來(lái)越多的證據(jù)顯示，炎癥在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病中起重要作用[1]。無(wú)論1型還是2型糖尿病腎病，早期腎組織中均有單核/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。浸潤(rùn)的單核/巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)及產(chǎn)生氧自由基等造成腎組織結(jié)構(gòu)的破壞，加速腎小球硬化的進(jìn)程。尤其近年腎臟間質(zhì)的病變?cè)谔悄虿∧I病發(fā)展中的作用逐漸得到認(rèn)可和重視。本人在以往的研究中也發(fā)現(xiàn)過(guò)巨噬細(xì)胞在糖尿病腎間質(zhì)中的浸潤(rùn)[2]。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）被證實(shí)具有獨(dú)立于降壓之外的腎保護(hù)作用[3]，國(guó)內(nèi)對(duì)于血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對(duì)糖尿病腎病發(fā)病早期的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)作用卻鮮有報(bào)道。因此本研究主要探討了血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對(duì)糖尿病大鼠腎臟中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響及與蛋白尿的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立

健康雄性SD大鼠24只（200～250 g）。隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）8只，糖尿病組（DM組）16只。糖尿病組大鼠禁食不禁水12 h后，予一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司）50 mg/kg。48 h后尾靜脈采血，快速血糖儀測(cè)隨機(jī)血糖，1周后復(fù)測(cè)空腹血糖，以兩次隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L和空腹血糖＞13.9 mmol/L為糖尿病模型建立成功，建模成功后將糖尿病組隨機(jī)分為2個(gè)亞組，1組為纈沙坦治療組（DV組），1組為糖尿病對(duì)照組（DC組）。治療組予50 mg/（kg·d）纈沙坦（北京諾華公司提供，160毫克/粒）灌胃，糖尿病對(duì)照組（DC組）和正常對(duì)照組（NC組）不予治療。正常對(duì)照組予等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液注射。在8周留取血、尿、組織標(biāo)本。

1.2 組織學(xué)常規(guī)檢查

腎組織石蠟切片行PAS和HE染色，觀察腎組織腎小球硬化程度和腎小管損害程度。腎小球系膜區(qū)增寬程度按0～3分的半定量計(jì)分方法評(píng)價(jià)：0級(jí)為無(wú)系膜增寬，計(jì)0分；1級(jí)為輕度系膜增寬，計(jì)1分；2級(jí)為中度系膜增寬，計(jì)2分；3級(jí)為重度系膜增寬，計(jì)3分。每個(gè)動(dòng)物至少評(píng)價(jià)30個(gè)腎小球，最終評(píng)分由所評(píng)價(jià)的動(dòng)物所有腎小球計(jì)分的平均值得出，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.3 免疫組織化學(xué)染色和量化

腎組織石蠟切片用小鼠抗-大鼠CD68抗體（識(shí)別大鼠巨噬細(xì)胞）（Serotec公司，UK）行免疫組織化學(xué)染色，最后套染無(wú)蘇木素的PAS。分別計(jì)算20個(gè)連續(xù)非重疊的腎皮質(zhì)區(qū)高倍鏡視野下（×400）CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)，除以高倍視野數(shù)，得每皮質(zhì)高倍視野下的平均細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

均數(shù)比較采用方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖、體質(zhì)量及腎重/體質(zhì)量變化

NC組大鼠隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，體質(zhì)量逐漸增加。而糖尿病大鼠隨著時(shí)間的延長(zhǎng)體質(zhì)量無(wú)明顯增加。DC組、DV組體質(zhì)量均低于NC組體質(zhì)量（P＜0.01）。DC組、DV組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖較NC對(duì)照組明顯增高（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 大鼠血糖、體質(zhì)量和24 h尿蛋白排泄量的測(cè)定

2.2 24 h尿蛋白排泄量

DC組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，24 h尿白蛋白的排泄量逐漸升高，各時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P＜0.01）。與NC組比較，DC組各時(shí)間24 h尿白蛋白的排泄量明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。DV組與DC組比較，蛋白尿有減輕趨勢(shì)，在8周時(shí)DV組較DC組尿白蛋白排泄率減少（P＜0.05）。

2.3 光鏡病理學(xué)變化

在DM組大鼠可以看到：腎小球體積增大，腎小球囊腔縮小，系膜區(qū)增寬，基底膜增厚以及腎小管肥大。而NC組無(wú)以上變化，DC組上述變化較DV組嚴(yán)重。8周時(shí)DC組與DV組腎小球系膜增寬半定量評(píng)分分別為（2.16±0.12） 和（1.74±0.40） （P＜0.01）。

2.4 腎臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)

免疫組化染色顯示在NC組大鼠腎間質(zhì)偶爾見(jiàn)到個(gè)別巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。DC組腎間質(zhì)內(nèi)有明顯巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，而在DV組巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況較DC組減輕。DC組與DV組8周腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)分別為（13.9±3.3）個(gè)/HPF和（8.3±2.7）個(gè)/HPF（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 腎間質(zhì)CD68+巨噬細(xì)胞免疫組化染色(×200；a：DC組；b：DV組)

3 討 論

在本研究中，我們探討了血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對(duì)鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，及其在糖尿病早期腎損害中的保護(hù)作用。結(jié)果顯示：在糖尿病大鼠腎臟中，腎間質(zhì)可見(jiàn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可明顯減輕巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和蛋白尿水平，伴隨光鏡病理學(xué)的變化。

在糖尿病腎病早期，腎小球表達(dá)過(guò)量單核細(xì)胞趨化蛋白-1、血管細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1等，導(dǎo)致組織局部單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，浸潤(rùn)的單核/巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子，炎性介質(zhì)及產(chǎn)生氧自由基等造成腎組織結(jié)構(gòu)的破壞，加速腎臟病變進(jìn)程。盡管糖尿病腎病在以往被強(qiáng)調(diào)為腎小球疾病，但是近年腎臟間質(zhì)的病變?cè)谔悄虿∧I病發(fā)展中的作用得到認(rèn)可和重視[4]?？刂七@一間質(zhì)炎癥過(guò)程，有可能延緩糖尿病的腎損害進(jìn)程。

我們通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)，在糖尿病成模后8周，此時(shí)腎臟中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著，而腎小球只有個(gè)別巨噬細(xì)胞。在血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療組，腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減輕，腎小球系膜增寬程度減輕。這些提示纈沙坦可能通過(guò)減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕腎臟病理改變，減少尿蛋白排出，從而有效防止或延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。

血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑為什么能減輕腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)？這可能與血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑選擇性與血管緊張素Ⅱ受體結(jié)合有關(guān)。血管緊張素Ⅱ（AgnⅡ）無(wú)法與受體結(jié)合，因而AgnⅡ誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化蛋白分泌減少，從而使單核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)減少[5]。

綜上所述，我們證實(shí)了血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對(duì)糖尿病大鼠腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的減輕作用。但是，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑是如何參與腎臟保護(hù)尚需深度研究。對(duì)炎癥浸潤(rùn)的拮抗有望成為延緩糖尿病腎病的新靶點(diǎn)之一。

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R587.1

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1671-8194（2014）18-0083-02

國(guó)家職業(yè)病臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：WY2011873）