張開(kāi)磊，王寶維

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所，國(guó)家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系營(yíng)養(yǎng)與飼料功能研究室，山東 青島 266109）

乳酸菌是一類能從可發(fā)酵性碳水化合物中產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的通稱，廣泛存在于人、畜、禽腸道、許多食品、物料及少數(shù)臨床樣品中[1]。因其獨(dú)特的生理學(xué)功能及對(duì)動(dòng)物的益生作用，正日益引起人們的重視[2]。馬治宇研究證明，乳酸菌可以改善雛雞日增重和料肉比，王晶等研究證實(shí)，乳酸菌能提高肉仔雞的免疫力[3]。目前，微生物發(fā)酵飼料處于新興階段，選擇合適的發(fā)酵菌種，決定飼料品質(zhì)的優(yōu)劣。選擇發(fā)酵飼料的菌種生長(zhǎng)速度和產(chǎn)酸量是試驗(yàn)選擇的關(guān)鍵。本試驗(yàn)對(duì)市售酸奶進(jìn)行乳酸菌分離，并對(duì)分離菌株的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)酸性能及生化指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，為該乳酸菌進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

酸奶由本地超市購(gòu)買，為內(nèi)蒙古伊利公司生產(chǎn)的發(fā)酵乳。

1.2 試驗(yàn)試劑及配制方法

MRS液體培養(yǎng)基（pH 6.8）：蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1mL，檸檬酸氫二胺2 g，MnSO4·H2O 0.25 g，MnSO4· 7H2O 0.58 g，K2HSO42 g，蒸餾水 1 000 mL，加海水晶15 g，調(diào)pH后121℃滅菌20min。

0.9 %NaCl溶液：稱取NaCl0.9 g，溶于100mL水，121℃滅菌20min。

20%CaCO3乳濁液：稱取CaCO320 g加入到100mL蒸餾水中，制成CaCO3乳濁液。

革蘭氏染色法各種染液的配制：結(jié)晶紫染液，結(jié)晶紫2.0 g、草酸銨0.8 g、95%酒精20mL、蒸餾水80mL，先將結(jié)晶紫溶于酒精，草酸銨溶于蒸餾水中，然后將兩液混合，靜置48 h，此染液穩(wěn)定，置密閉的棕色瓶中可儲(chǔ)存數(shù)月；革蘭氏碘液，碘1.0 g、碘化鉀2.0 g、蒸餾水300mL，先將碘與碘化鉀混合，加水少許，略加搖動(dòng)，待碘完全溶解后再加蒸餾水至定量；脫色劑為95%酒精；復(fù)染劑為番紅（沙黃）染液，沙黃0.25g、95%乙醇10mL、蒸餾水適量，將沙黃溶解于95%乙醇中，待完全溶解再加蒸餾水至100mL。

1.3 菌種的分離純化

在超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下，將酸奶用無(wú)菌水稀釋，梯度為1∶10。取0.2mL涂布于改良MRS瓊脂上（培養(yǎng)基上加入CaCO3乳濁液1mL），30℃厭氧培養(yǎng)，直到出現(xiàn)CaCO3溶解圈的菌落，然后重復(fù)劃平板分離出單菌落。

1.4 分離株菌落形態(tài)特性及生化鑒定

挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后觀察菌株的菌體形態(tài)，然后進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行耐氧、產(chǎn)酸、試管凝集和固體發(fā)酵檢測(cè)試驗(yàn)，并用乳酸菌生理生化微量發(fā)酵管進(jìn)行生化鑒定。

1.5 乳酸菌生長(zhǎng)曲線

根據(jù)費(fèi)翅鯤等在MRS液體培養(yǎng)基中加入5%的菌液后，測(cè)定OD690nm值，每隔2 h取1次菌液檢測(cè)其OD690nm值，繪制乳酸菌生長(zhǎng)曲線[4]。

1.6 乳酸菌酸度

酸度以吉爾涅爾度（oT）表示，即每100mL發(fā)酵液消耗1mL 0.1mol·L-1NaOH溶液記為1oT[5]。測(cè)定時(shí)，將0.1mol·L-1NaOH溶液裝入堿式滴定管中。用移液管分別吸取上述不同時(shí)間段的菌液2 mL于小燒杯中，將標(biāo)定好的精密酸度計(jì)探頭插入燒杯中，使探頭與菌液充分接觸。然后一邊用氫氧化鈉滴定一邊注視酸度計(jì)讀數(shù)，以pH剛好為7時(shí)停止滴定，記下所用NaOH溶液的量，算出相應(yīng)的吉爾涅爾度，繪制酸度變化曲線。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 分離株形態(tài)鑒定

乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上的菌落特征見(jiàn)圖1。

圖1 乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上的菌落特征

由圖1可見(jiàn)，從樣品中共分離出20株能產(chǎn)生溶解圈的菌株，純化后在MRS培養(yǎng)基上形成表面光滑、邊緣整齊、中央隆起、易于刮起的直徑約1mm的奶油狀菌落。經(jīng)過(guò)半固體瓊脂菌株的運(yùn)動(dòng)性檢穿刺試驗(yàn)證明，菌株均生長(zhǎng)于接種的穿刺線上，邊緣清晰，無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象，表明均無(wú)運(yùn)動(dòng)性。

2.2 細(xì)菌形態(tài)觀察

顯微鏡下乳酸菌形態(tài)見(jiàn)圖2。

圖2 顯微鏡下乳酸菌形態(tài)

將分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下可見(jiàn)兩端平直的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，單個(gè)或呈短鏈排列。

2.3 乳酸菌液體培養(yǎng)結(jié)果

接種細(xì)菌試管與對(duì)照試管的比較見(jiàn)圖3。

由圖3可見(jiàn)，本試驗(yàn)中接種細(xì)菌的試管變渾濁，對(duì)照試管澄清，由此可知，接種細(xì)菌的試管內(nèi)為乳酸菌，無(wú)雜菌污染。

圖3 接種細(xì)菌試管與對(duì)照試管的比較

2.4 分離株生理生化鑒定

分離株生理生化特性見(jiàn)附表。

附表 分離株生理生化特性

該分離株無(wú)鞭毛、無(wú)芽孢、革蘭氏染色呈陽(yáng)性，在30℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h能長(zhǎng)出乳白色扁圓形凸?fàn)罹?。將該分離株接種到脫脂乳試管后，置于42℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，脫脂乳凝固但無(wú)氣泡產(chǎn)生，測(cè)定pH呈酸性。將該分離株乳酸發(fā)酵后，產(chǎn)物經(jīng)硫酸和高錳酸鉀處理，可使含氨硝酸銀濾紙條變黑。對(duì)分離菌株進(jìn)行微量生化反應(yīng)管鑒定[6]。結(jié)果顯示，該菌株對(duì)葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、山梨醇、七葉苷和水楊苷反應(yīng)呈陽(yáng)性，對(duì)精氨酸雙水解酶、明膠液化和還原性硝酸鹽反應(yīng)呈陰性。上述特征表明，該株分離菌為乳酸菌屬[7]。

2.5 乳酸菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

乳酸菌生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4。

由圖4可知，當(dāng)加入5%的菌液后，測(cè)定OD690nm值為0.436，前18 h乳酸菌繁殖迅速，OD690nm值持續(xù)上升，乳酸菌濃度逐漸增大，20～36 h時(shí)菌體密度基本一致，乳酸菌處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期。

2.6 乳酸菌酸度測(cè)定結(jié)果

乳酸菌產(chǎn)酸量的測(cè)定見(jiàn)圖5。

圖5 乳酸菌產(chǎn)酸量的測(cè)定

由圖5可知，從接種到20 h，培養(yǎng)液中的pH持續(xù)下降，說(shuō)明此刻乳酸菌處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，持續(xù)產(chǎn)酸；20 h后穩(wěn)定約為3.64，此刻乳酸菌處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期，產(chǎn)酸量降低。這與圖4生長(zhǎng)曲線一致。

3 討 論

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)連續(xù)20多年以年均增率＞9%的高速度增長(zhǎng)，畜牧生產(chǎn)區(qū)的飼料資源短缺問(wèn)題也將越來(lái)越嚴(yán)重[8]。因此，積極開(kāi)發(fā)新的飼料資源，提高現(xiàn)有飼料利用率已迫在眉睫。微生物發(fā)酵飼料可改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，從而提高飼料利用效率。王春林等研究證明，發(fā)酵飼料可顯著提高豬的生產(chǎn)性能和屠宰性能[9]。選擇合適的發(fā)酵菌種是微生物發(fā)酵飼料成功關(guān)鍵。菌種本身不能產(chǎn)生有毒物質(zhì)，符合安全性的原則；并且菌體本身具有很好的生長(zhǎng)代謝活力，能有效地降解大分子物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子，合成小肽和有機(jī)酸等有益物質(zhì)[10]。

研究表明，乳酸菌具有改善腸道功能、提高機(jī)體免疫力、改善機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況等作用[11]。其中改善營(yíng)養(yǎng)狀況、提高免疫等作用已在食品、醫(yī)藥方面廣泛應(yīng)用。乳酸菌在畜牧業(yè)中應(yīng)用，可提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，改善消化道微生態(tài)環(huán)境，調(diào)節(jié)消化道免疫系統(tǒng)[12]。大量研究證明，乳酸菌對(duì)人和動(dòng)物體保健和治療都有較好療效。張驍勇在育成梅花鹿飼糧中添加未調(diào)酸的乳酸菌添加劑，結(jié)果表明，添加未調(diào)酸的乳酸菌添加劑10 g·d-1·頭-1，能提高梅花鹿采食量[13]。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)此株乳酸菌株采用形態(tài)學(xué)、生理生化特性和運(yùn)動(dòng)性等鑒定，根據(jù)鑒定手冊(cè)可以初步判定屬于乳桿菌屬，其形態(tài)與乳酸鏈球菌相符，鑒定該乳酸菌可能為乳酸鏈球菌，但還需后續(xù)試驗(yàn)證明其是否是乳酸鏈球菌。本試驗(yàn)中采用OD690nm值來(lái)反應(yīng)乳酸菌菌液的濃度，雖然不能得知菌體的數(shù)量，但在一定程度可以對(duì)比不同時(shí)間下的菌體濃度，且操作迅速，簡(jiǎn)便。

乳酸菌在其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中能夠產(chǎn)生乳酸，乳酸能夠降低動(dòng)物腸道pH；可以提高鈣、磷、鐵的利用率，并促進(jìn)鐵和維生素D的吸收；腸道pH降低可有效抑制致病菌，如痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、彎曲桿菌、葡萄球菌等的生長(zhǎng)，為有益菌的生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件[14]。培養(yǎng)液pH動(dòng)態(tài)變化主要是由乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生乳酸引起，乳酸的積累影響乳酸菌的生長(zhǎng)，Sobrun等研究證明，乳酸菌的產(chǎn)酸量和生長(zhǎng)速度成線性相關(guān)，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致[15]。試驗(yàn)中18 h該菌到達(dá)對(duì)數(shù)期，此時(shí)OD690nm值為2.104，18 h時(shí)菌株的產(chǎn)酸量到達(dá)穩(wěn)定，pH為3.45，該菌較李鳳梅等選擇的乳酸菌株生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)酸量高[16]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法酸度的定義為以酚酞作指示劑所需的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。但在本試驗(yàn)中參照劉文華等研究，采用酸度計(jì)進(jìn)行酸度測(cè)定，與國(guó)標(biāo)法相比更方便、快捷、準(zhǔn)確，適合實(shí)驗(yàn)室操作[5]。試驗(yàn)中采用CaCO3溶解圈法進(jìn)行乳酸菌的分離，此法較普通方法簡(jiǎn)單，效果明顯。因本試驗(yàn)中的菌種從市售酸奶獲得，符合安全性原則，且生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)生有機(jī)酸速度快，符合本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，篩選的株菌為乳酸菌，且生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期為18 h，產(chǎn)酸速度快，產(chǎn)酸量高，適合作為微生物發(fā)酵飼料的菌種。

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