李加興 房惠芳 陳選 吳越 涂媛 周炎輝

LI Jia－xing 1 FANG Hui－fang 1 CHEN Xuan 2 WU Yue 2 TU Yuan 2 ZHOU Yan－h(huán)ui 2

（1.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000；2.湖南奇異生物科技有限公司，湖南 長沙 410008）

（1.Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hunan 416000，China；2.Hunan Amazing Grace Biotechnology Co.，Ltd.，Changsha，Hunan 410008，China）

牡丹在藥用區(qū)域的研究開發(fā)一直受到重視，其藥用的主要部位是根皮即丹皮，具有清熱涼血、活血散瘀的功效［1，2］。牡丹籽是生產(chǎn)牡丹皮的副產(chǎn)物，含油量為23.76%～27.06%［3］。研究［4］表明，牡丹籽油不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上，具有降血脂、降血糖等作用［5］，近年來發(fā)展成為又一種極具開發(fā)利用前景的高級木本食用油。而提取牡丹籽油后的牡丹籽粕中的粗蛋白含量高達(dá)26.98%［6］，可作為提取植物蛋白的資源加以綜合利用。

國內(nèi)外提取蛋白有很多方法，主要有堿提法、鹽提法、水提法等［7－9］。堿提酸沉法目前仍是提取蛋白的常用方法，因其不會(huì)生成有害物質(zhì)，對環(huán)境污染相對較小，并且適用于工業(yè)化生產(chǎn)，因而被廣泛運(yùn)用于天然植物蛋白的提取，如花生蛋白、玉米谷蛋白、油茶籽蛋白、大米蛋白、麥麩蛋白等［10－16］，但尚未見此法應(yīng)用于提取牡丹籽粕蛋白的相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬對堿提酸沉法提取牡丹籽粕蛋白的工藝條件進(jìn)行研究，并測定其蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，為牡丹籽粕的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹籽粕：以湘西永順牡丹栽培基地的牡丹籽為原料，經(jīng)超臨界CO2萃取提油后所剩余的部分，經(jīng)檢測其蛋白質(zhì)含量為25.91%（以微量凱氏定氮法測定［17］）；

石油醚（60～90℃）：分析純，天津市天力試劑化學(xué)有限公司；

牛血清蛋白、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

考馬斯亮藍(lán)G－250：北京中生瑞泰科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

定氮儀：KDN－2C型，上海纖檢儀器有限公司；

消化爐：HYP－Ⅱ型，上海纖檢儀器有限公司；

微型植物粉碎機(jī)：FZ102型，天津市泰斯特儀器有限公司；飛鴿牌離心機(jī)：LXJ－IIB型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

實(shí)驗(yàn)室p H計(jì)：雷磁PHS－J4A型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

可見分光光度計(jì)：723型，上海菁華科技有限公司；

恒溫水浴鍋：二列四孔 HH.S21－Ni4型，上海寰熙醫(yī)療器械有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101－2AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；

高精度電子天平：JA－5103N型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

牡丹籽粕→粉碎→干燥→過篩→脫脂→調(diào)節(jié)p H→恒溫浸提→離心分離→上清液加酸沉淀→靜置→離心沉淀→沉淀調(diào)p H至中性→冷凍干燥→牡丹蛋白

1.3.2 操作要點(diǎn) 將牡丹籽粕粉碎后干燥，過60目篩，以石油醚為溶劑，采用索氏抽提法去除牡丹籽粕中殘留的油脂，之后低溫烘干，備用。精確稱取5.0 g脫脂牡丹籽粕置于燒杯中，按一定料液比加入蒸餾水，并加堿液調(diào)p H，在設(shè)定的提取溫度和提取時(shí)間下提取蛋白，之后于3 000 r／min下離心20 min，收集上清液，上清液加1 mol／L稀鹽酸調(diào)p H至等電點(diǎn)，靜置2～3 h后離心收集沉淀，沉淀調(diào)p H至中性，冷凍干燥后即得粗蛋白。

1.3.3 牡丹籽粕蛋白等電點(diǎn)測定 稱取10 g樣品，按料液比1∶15（m∶V）加水，并用氫氧化鈉溶液調(diào)p H 至10.0，45℃恒溫浸提80 min，離心（3 000 r／min、20 min）取上清液，取1 m L上清液稀釋100倍后再取1 m L測吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)含量；再分取6份上清液各14 mL，加鹽酸調(diào)p H 值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，3 000 r／min離 心20 min，上清液稀釋100倍，分別取1 m L測吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。按式（1）計(jì)算蛋白質(zhì)沉淀率，沉淀量最大時(shí)的p H即為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)［18］。

式中：

R——蛋白質(zhì)沉淀率，%；

m1——酸沉前上清液蛋白質(zhì)含量，mg／m L；

m2——酸沉后上清液蛋白質(zhì)含量，mg／m L。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）料液比對牡丹籽粕蛋白提取率的影響：設(shè)定提取溫度45℃、提取時(shí)間60 min、p H 10，分別控制料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（m∶V）提取牡丹籽蛋白，探討料液比對牡丹籽粕蛋白提取率的影響。

（2）提取時(shí)間對牡丹籽粕蛋白提取率的影響：設(shè)定提取溫度45℃、料液比1∶15（m∶V）、p H 10，分別控制提取時(shí)間為40，60，80，100，120 min，探討提取時(shí)間對牡丹籽粕蛋白提取率的影響。

（3）提取溫度對牡丹籽粕蛋白提取率的影響：設(shè)定提取時(shí)間80 min、p H 10、料液比1∶15（m∶V），分別控制提取溫度為25，35，45，55，65℃，然后計(jì)算蛋白質(zhì)提取率，探討提取溫度對牡丹籽粕蛋白提取率的影響。

（4）p H對牡丹籽粕蛋白提取率的影響：設(shè)定浸提溫度45℃、浸提時(shí)間80 min、料液比1∶15（m∶V），分別用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)p H至7，8，9，10，11，探討p H 對牡丹籽粕蛋白提取率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對料液比、提取時(shí)間、提取溫度和p H采用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，以確定提取牡丹籽粕蛋白的最佳工藝條件。

1.3.6 牡丹籽粕中蛋白質(zhì)含量的測定 微量凱氏定氮法［17］。

1.3.7 上清液中的蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法［19，20］。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在一定濃度的乙醇及酸性條件下，考馬斯亮藍(lán)G－250可配成淡紅色溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定，并在465～595 nm處有最大的光吸收值，因此可以通過檢測595 nm下的吸光度來計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。準(zhǔn)備6支具塞試管，分別取濃度為0，0.03，0.06，0.09，0.12，0.15 mg／m L牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 m L于試管中，然后加入5.0 m L考馬斯亮藍(lán)G－250，充分振蕩混合，放置5 min后，于595 nm處測吸光度A值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制曲線，見圖1，得線性回歸方程為Y＝4.951 4 X－0.013 5（R2＝0.997 7）。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of bovine serum albumin

（2）樣品的測定：將離心后的牡丹籽粕蛋白溶液定容到100 m L，從中取1 m L再次定容到50 m L，得到待測液，之后取待測液1 m L按上述步驟測定吸光度A值，計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.8 蛋白質(zhì)提取率的測定 蛋白質(zhì)提取率按式（2）計(jì)算：

式中：

R——蛋白質(zhì)提取率，%；

c1——上清液蛋白質(zhì)含量，mg／m L；

c0——脫脂牡丹籽粕蛋白質(zhì)含量，mg／m L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所測結(jié)果均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，利用SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹籽粕蛋白質(zhì)酸沉等電點(diǎn)分析

由圖2可知，在所測p H值范圍內(nèi)，牡丹籽蛋白的沉淀率隨著p H的增大呈先增加后降低的趨勢，在p H＝4時(shí)沉淀率最大，達(dá)94.55%。因此，在牡丹籽粕蛋白的酸沉工序中選擇p H為4.0，可最大程度地沉淀蛋白質(zhì)，提高提取率。

圖2 p H對蛋白沉淀率的影響Figure 2 Effects of p H values on protein deposition rate

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對牡丹籽粕蛋白提取率的影響 由圖3可知，料液比≤1∶15（m∶V）時(shí)，牡丹籽粕蛋白提取率隨料液比的增加而增加，之后逐漸趨于不變。這可能是因?yàn)樵诹弦罕取?∶15（m∶V）時(shí)，由于溶液的黏度較大，分子擴(kuò)散速率較低，體系分散不均勻，影響了提取液中的蛋白質(zhì)溶出，因此蛋白質(zhì)的提取率較低［21］；隨著料液比的增加，蛋白質(zhì)的溶出較充分，因而提取率逐漸增大；但是過大的料液比不僅增加了水的消耗及后續(xù)的濃縮成本，而且容易導(dǎo)致加工過程中溶質(zhì)的丟失［22］。因此，綜合考慮上述因素，選擇料液比為1∶15（m∶V）左右較為適宜。

圖3 料液比對蛋白提取率的影響Figure 3 Effect of different solid－liquid ratio on protein yield

2.2.2 提取時(shí)間對牡丹籽粕蛋白提取率的影響 由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長，牡丹籽粕蛋白的提取率逐漸增加；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到80 min時(shí)，牡丹籽粕蛋白的提取率達(dá)到最大，為79.57%；而提取時(shí)間過長可能會(huì)使部分蛋白變性導(dǎo)致提取率下降［23］，故選擇提取時(shí)間為80 min較為適宜。

2.2.3 提取溫度對牡丹籽粕蛋白提取率的影響 由圖5可知，隨著提取溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率不斷提高，當(dāng)溫度為45℃時(shí)提取率達(dá)最大，為80.17%。這是由于蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)隨著溫度的升高而伸展，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶解，并且水分子的熱運(yùn)動(dòng)也加劇，蛋白質(zhì)與水分子接觸的幾率增加，使溶解性進(jìn)一步增加，從而提取率不斷提高。但當(dāng)提取溫度超過45℃后，提取率反而有所降低，這是因?yàn)闇囟冗^高時(shí)維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的次級鍵破壞，引起天然構(gòu)象解體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，故提取率下降［24］。綜合考慮，提取溫度選取45℃左右為宜。

圖4 提取時(shí)間對蛋白提取率的影響Figure 4 Effect of different extraction time on protein yield

圖5 提取溫度對蛋白提取率的影響Figure 5 Effect of extraction temperature on protein yield

2.2.4 浸提液p H對牡丹籽粕蛋白提取率的影響 由圖6可知，在p H為7～10時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率隨著p H的增大呈上升趨勢，且提取率在p H達(dá)到10時(shí)最大，為83.56%；當(dāng)p H＞10時(shí)，提取率呈下降趨勢。這可能是由于p H過高，強(qiáng)堿環(huán)境破壞了蛋白質(zhì)的次級鍵，使蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)解體而引起變性所導(dǎo)致；同時(shí)p H值太高，在酸沉?xí)r會(huì)消耗大量的堿，導(dǎo)致產(chǎn)品中鹽分增加，不利于后續(xù)的分離工序［25］。因此，浸提液p H選擇為10左右較為適宜。

圖6 浸提p H值對蛋白提取率的影響Figure 6 Effect of different extracting solution p H on protein yield

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

堿提酸沉法提取牡丹籽粕蛋白的正交試驗(yàn)因素水平表見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，4個(gè)因素對牡丹籽粕蛋白提取率的影響順序依次為A＞D＞C＞B，即提取時(shí)間＞料液比＞p H＞提取溫度，最佳工藝組合為A3B3C3D3，即料液比1∶20（m∶V）、提取時(shí)間100 min、提取溫度55℃、p H 11。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析Table 2 Results and analysis of L9（34）orthogonal test

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)工藝條件，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，測得牡丹籽粕蛋白的提取率分別為84.38%，86.51%，89.43%，平均值為86.77%，表明牡丹籽粕蛋白提取的最佳工藝切實(shí)可行。

3 結(jié)論

（1）采用堿提酸沉法提取牡丹籽蛋白，料液比對提取率的影響最大，其次為提取時(shí)間與p H，而提取溫度的影響最小，各因素對牡丹籽粕蛋白提取率均有顯著影響（P＜0.05）；提取最佳工藝條件為料液比1∶20（m∶V）、提取時(shí)間100 min、提取溫度55℃、p H 11，在該條件下牡丹籽粕蛋白的提取率可達(dá)86.77%；牡丹籽粕蛋白的等電點(diǎn)為p H 4.0，沉淀率最大可達(dá)94.55%。

（2）試驗(yàn)結(jié)果表明，采用堿提酸沉法提取牡丹籽蛋白可行，可為牡丹籽綜合利用提供技術(shù)參考。下一步將對牡丹籽粕蛋白質(zhì)的氨基酸組成做進(jìn)一步分析，以確定其具體應(yīng)用方向。

1 史國安，郭香鳳，金寶磊，等.牡丹籽油超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化及抗氧化活性的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2013，28（4）：47～50.

2 易軍鵬，朱文學(xué)，馬海樂，等.牡丹籽的化學(xué)成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009（21）：604～607.

3 張萍.牡丹籽油的制備、純化、成分分析以及功效評價(jià)［D］.北京：首都師范大學(xué)，2012.

4 高婷婷，王亞蕓，任建武.GC—MS法分析牡丹籽油的成分及其防曬效果的評定［J］.食品科技，2013，38（6）：296～299.

5 董振興，彭代銀，宣自華，等.牡丹籽油降血脂、降血糖作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（8）：1 286～1 288.

6 龐雪風(fēng)，何東平，胡傳榮，等.牡丹籽油的提取及蛋白制備工藝的研究［J］.食品工業(yè)，2013，34（8）：73～76.

7 Vose J R.Production and functionality of starches and protein isolates from legume seeds（field peas and horsebean）［J］.Cereal Chemistry，1980，57（6）：406～410.

8 朱旻鵬，謝玉國，田將，等.超聲波輔助堿液提取芝麻餅粕蛋白工藝的研究［J］.油脂工程，2007（8）：83～86.

9 鄭亞軍，陳華，李艷，等.椰子分離蛋白質(zhì)提取工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009（1）：226～227.

10 周振，周能.仁東大蒜蛋白質(zhì)的測定［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28（5）：22～23.

11 趙東海，張洪，黃建邵.蠶豆蛋白提取工藝的研究［J］.食品與機(jī)械，2005，21（2）：32～33.

12 楊偉強(qiáng)，禹山林，袁濤.堿提酸沉法制取花生分離蛋白工藝研究［J］.花生學(xué)報(bào)，2008，37（4）：12～17.

13 張鐵，劉曉蘭，鄭喜群.利用堿提酸沉法從膨化玉米黃粉中提取谷蛋白［J］.食品與機(jī)械，2012，28（2）：123～125.

14 李婷婷，張暉，吳彩娥，等.油茶籽糖蛋白提取工藝優(yōu)化及抗氧化性［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2012，43（4）：148～155.

15 郭榮榮，潘思軼，王可興.堿法與酶法提取大米蛋白工藝及功能特性比較研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（3）：173～176.

16 徐忠，薄凱，張珍珠.麥麩蛋白的堿法提取工藝及乳化性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技，2006，27（9）：66～71.

17 陳智慧，史梅，王秋香，等.用凱氏定氮法測定食品中的蛋白質(zhì)含量［J］.新疆畜牧業(yè)，2008（5）：22～24.

18 李加興，孫金玉，陳雙平，等.獼猴桃籽粕蛋白提取工藝研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2006，6（6）：15～18.

19 趙玉紅，李莉.超聲波輔助提取松仁蛋白的工藝研究［J］.中國林副特產(chǎn)，2008（1）：6～8.

20 楊正坤，王秀麗，尨施華，等.考馬斯亮藍(lán)染色法測定大豆莖葉中蛋白質(zhì)含量［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（20）：4 611～4 612.

21 王振宇，楊麗娜，李宏菊.堿提酸沉提取紅松仁分離蛋白的工藝研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，20（6）：71～74.

22 范三紅，劉艷榮，原超.南瓜籽蛋白質(zhì)的制備及其功能性質(zhì)研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（16）：97～100.

23 潘妍，呂春健，謝傳磊，等.酶法提取綠豆蛋白及其功效的初步研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（9）：238～241.

24 潘晶，張暉，王立，郭曉娜，等.棉籽蛋白兩步法提取及其功能性質(zhì)研究［J］.中國油脂，2010，35（7）：19～23.

25 高榮麗，陶冠軍，楊嚴(yán)俊.葵花籽粕的綜合利用［J］.食品工業(yè)科技，2006，27（7）：138～140.