劉福秀等

摘 要 利用感染了建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的文心蘭葉片，建立同步檢測文心蘭2種病毒的雙重RT-PCR方法，該方法可一次性擴增出2種病毒的DNA條帶，最低可檢測到相當(dāng)于1 μg的帶毒葉片。同時采用花梗組織培養(yǎng)脫毒并結(jié)合培養(yǎng)基添加病毒A的脫毒方法，對感染2種病毒的文心蘭進行外植體脫毒試驗，獲得文心蘭組培苗脫毒方法。用建立的雙重RT-PCR檢測脫毒效果，脫毒率為75.3%。

關(guān)鍵詞 建蘭花葉病毒（CymMV）；齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）；RT-PCR；文心蘭；脫毒

中圖分類號 S682.31 文獻標(biāo)識碼 A

Rapid Detection of 2 Main Viruses in Oncidium and the Method

of Virus Elimination by Plant Tissue Culture

LIU Fuxiu， WANG Anshi， HAN Yuchun， LIN Mingguang*

Hainan Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau， Haikou， Hainan 570311， China

Abstract A duplex RT-PCR method was developed for rapid detection of Oncidium infected 2 important virus， Cymbidium mosaic virus（CymMV）and Odontolossum ring spot virus（ORSV）， in one step. It could detect the virus as low as 1 μg leaf tissue. And a method of virus elimination by plant tissue culture was developed. It combined with lateral mud tissue culture and an anti-virus reagent， virus A， and verified the effect of virus-free by duplex RT-PCR. The results showed that the virus-free rates of this lateral bud culture were 75.3%.

Key words Cymbidium mosaic virus； Odontolossum ring spot virus； RT-PCR； Oncidium； Virus elimination

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.025

文心蘭（Oncidium）又名跳舞蘭、舞女蘭、金蝶蘭、瘤瓣蘭等，系蘭科文心蘭屬植物的總稱，屬于熱帶復(fù)莖性著生蘭，原產(chǎn)于西印度群島、墨西哥、巴西等地[1-3]。以其花姿優(yōu)美、花色亮麗搶眼，甚具喜氣，在西洋插花或是節(jié)慶活動上常被廣泛應(yīng)用。隨著市場需求量的增大，文心蘭得到大量推廣種植，種苗主要通過組培快繁獲得。但在生長過程中易受到多種病毒的危害，嚴重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，其中以建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontolossum ring spot virus，ORSV）發(fā)生最為普遍，且這兩種病毒通常在文心蘭上復(fù)合感染，造成更為嚴重的危害[4-7]。目前對病毒病害的防治主要采用莖尖組織培養(yǎng)結(jié)合熱處理技術(shù)[1，8-9]，但有關(guān)文心蘭脫毒處理卻少有報道，雖然朱根發(fā)等[10]早在1997年就有了關(guān)于“文心蘭脫毒快繁技術(shù)研究”的報道，并且通過ELISA法對脫毒后樣品中包括CymMV和ORSV在內(nèi)的4種病毒進行了檢測，但作者研究所使用的材料未經(jīng)過病毒檢測，整個脫毒過程也沒有專門的病毒抑制步驟和污染控制方法，只在檢測誘導(dǎo)出的文心蘭原球莖時均未發(fā)現(xiàn)病毒。

為增強我國文心蘭產(chǎn)業(yè)的國際競爭力，本研究采用不同的脫毒方法，對感染CymMV和ORSV的文心蘭種苗進行外植體脫毒試驗，探索出文心蘭脫毒處理的適宜方法，并獲得文心蘭完全脫毒苗。

多重PCR方法可以通過1次試驗同時檢測2種或2種以上的病毒，如Kuroda等[11]建立了可同時檢測黃瓜花葉病毒（CMV）、蠶豆萎蔫病毒（BBWV-2）和三葉草黃脈病毒（ClYVV）的多重RT-PCR技術(shù)；Ito等[12]建立了可檢測柑橘裂皮類病毒（CEVd）等6種病毒的多重RT-PCR技術(shù)，Xie等[13]建立了一步法RT-PCR同時檢測4種甘蔗病毒的方法。本研究建立了文心蘭兩種主要病毒的雙重RT-PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

帶毒和健康供試文心蘭均采自海南文昌市熱帶植物隔離檢疫農(nóng)場的文心蘭鮮切花品種圃。DAS-ELISA所用的堿性磷酸酶標(biāo)記的CymMV和ORSV檢測試劑盒，購自ADGEN公司。RNA提取試劑盒和RT-PCR試劑購自大連TaKaRa公司。20%病毒A可濕性粉劑購自安徽淮南山河藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank公布的CymMV的外殼蛋白（coat protein，CP）基因和ORSV CP 基因的保守序列，分別設(shè)計RT-PCR的2對特異性引物，由上海Sangon公司合成。引物信息見表1。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（DAS-ELISA） 稱取100 mg樣品葉片，加磷酸緩沖液充分研磨，將研磨所得汁液于3 000 r/min離心5 min，取病汁液上清進行雙抗體夾心（DAS-ELISA）檢測。以DAS-ELISA和RT-PCR結(jié)果均為陽性的樣品為陽性樣品，均為陰性的樣品為陰性樣品進行組織培養(yǎng)。

1.2.3 雙重RT-PCR方法及特異性試驗 將100 mg DAS-ELISA檢測CymMV和ORSV均為陽性的樣品葉片用液氮研磨后，利用RNA提取試劑盒提取總RNA。以提取的RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄體系20 μL，10 mmoL/L dNTPs 1 μL、20 μmoL/L CyR引物1.5 μL、20 μmoL/L OR引物1.5 μL、RNA模板1 μL，70 ℃反應(yīng)5 min，冰上放置5 min，加入AMV酶5倍緩沖液4 μL、200 U/μL AMV RT（反轉(zhuǎn)錄酶）1 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑1 μL，加DEPC-H2O補足20 μL，單一病毒檢測時引物改為2.0 μL，其余不變，42 ℃反應(yīng)1 h。

PCR反應(yīng)體系20 μL，上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL、10倍PCR緩沖液（含Mg2+） 2 μL、10 mmoL/L dNTPs 0.6 μL、4條引物各0.5 μL、2 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，滅菌ddH2O補足20 μL，單一病毒檢測時只加其中一對引物。于PCR儀（Veriti 96 Well Thermal Cycler，Applied Biosystems）上進行擴增，反應(yīng)程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min 20 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

擴增結(jié)束后取15 μL PCR產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，并用Syngene GBOX CHEMI XR5凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.2.4 克隆與測序 PCR產(chǎn)物電泳后分別割膠回收，依次克隆到pMD18-T載體（TaKaRa）上，酶切鑒定陽性克隆后，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。每個產(chǎn)物至少測3個克隆，每個克隆都進行正反向測序。

1.2.5 檢測靈敏度的確定 提取得到的植物總RNA最后溶于30 μL DEPC處理ddH2O。將所得植物總RNA按10倍梯度依次稀釋，按上述方法進行cDNA合成和PCR擴增，取15 μL進行電泳分析。

1.2.6 脫毒 按照王安石等[14]通過組織培養(yǎng)的方法獲得增殖至第3代的組培苗，從繼代第4次時開始在培養(yǎng)基中分別添加0、5、10、15 mg/L病毒A，連續(xù)添加3代。病毒A使用前經(jīng)滅菌的0.22 μm細菌過濾器過濾。用DAS-ELISA和RT-PCR檢測第6代組培苗的脫毒效果并統(tǒng)計原球莖的誘導(dǎo)與增殖情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重RT-PCR檢測

用雙重PCR體系分別檢測單獨感染CymMV、ORSV以及復(fù)合感染兩種病毒的樣品，RT-PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果單獨感染CymMV的樣品獲得1條大小約670 bp DNA擴增片段，結(jié)果單獨感染ORSV的樣品獲得1條大小約520 bp DNA擴增片段，復(fù)合感染兩種病毒的樣品同時獲得670 bp和520 bp兩條DNA擴增片段，均與預(yù)期結(jié)果一致，而健康植株和清水對照都沒有擴增片段出現(xiàn)（圖1）?？寺y序后在GenBank中BLAST檢索，結(jié)果675 bp較大片段的序列與GenBank中已發(fā)布的CymMV相應(yīng)序列一致性達95%以上。524 bp較小片段的序列與GenBank中已發(fā)布的ORSV相應(yīng)序列的序列一致性達96%以上。表明擴增的片斷分別來自CymMV和ORSV，即該方法能準(zhǔn)確檢測出這兩種病毒。

2.2 靈敏度檢測結(jié)果

將所得植物總RNA按10倍梯度依次稀釋后進行RT-PCR，均能擴增出清晰的條帶。CymMV單重RT-PCR檢測時稀釋106倍后仍能擴增出條帶；ORSV單重RT-PCR檢測時稀釋105倍后仍能擴增出條帶，但稀釋106倍后擴增不出明顯的條帶；而雙重RT-PCR檢測時只能擴增出稀釋104倍目的條帶，稀釋105倍后不能擴增出條帶（圖2）。因此，可以用本研究方法檢測文心蘭中的CymMV和ORSV，且檢測靈敏度至少能達到105倍，雖比單重RT-PCR檢測靈敏度稍低，但比DAS-ELISA檢測靈敏度（數(shù)據(jù)未公布）至少高103倍。

2.3 病毒A對組培苗生長的影響

以健康蘭株花梗為外殖體，進行組培擴繁，不同濃度的病毒A對原球莖誘導(dǎo)與增殖的影響見表2。從表2可以看出，病毒A濃度在10 mg/L以下時對原球莖誘導(dǎo)與增殖影響與不添加病毒A時差異不明顯，但當(dāng)病毒A的濃度增加到15 mg/L時，開始出現(xiàn)生長抵制現(xiàn)象。

2.4 病毒A對脫毒效果的影響

在增殖培養(yǎng)基中分別添加0、5、10、15 mg/L病毒A，選取分別攜帶CymMV、ORSV及兩種病毒復(fù)合感染的蘭株花梗為外植體進行組培脫毒處理，帶毒情況用DAS-ELISA和RT-PCR檢測，兩種結(jié)果均為陽性的蘭株花梗為陽性樣品，以健康蘭株花梗為陰性樣品。于煉苗結(jié)束后移栽前隨機抽取96株小苗，同樣用DAS-ELISA和RT-PCR檢測小苗帶病毒率。結(jié)果所有陰性樣品兩種檢測方法均未檢測到病毒，且使用病毒A處理的脫毒率明顯高于不使用病毒A處理。隨著病毒A濃度的增高，脫毒率隨之升高。病毒A濃度為5 mg/L時，脫毒效果不理想，DAS-ELISA也能檢測到病毒，雙重RT-PCR檢測的脫毒率有時不足50%。但病毒A濃度達到10 mg/L及以上時，所有陽性樣品組培苗用DAS-ELISA均未檢測到病毒，雙重RT-PCR檢測的脫毒率均達70%以上，且復(fù)合感染樣品檢測時兩種病毒均同時出現(xiàn)。結(jié)果見表3。

3 討論與結(jié)論

近年來應(yīng)用RT-PCR技術(shù)建立了多種蘭花病毒快速檢測方法，并通過不斷優(yōu)化檢測程序來提高檢測特異性、縮短檢測時間、提高檢測效率。但是這些方法均是針對單一病毒進行檢測。為了降低檢測成本、縮短病毒檢測時間，周國輝等[15]、鄭國華等[16]、曾燕君等[17]先后建立了雙重RT-PCR同時檢測2種蘭花病毒的方法，有效地解決了這一問題，并利用該方法對田間蘭花進行了病毒檢測。但均沒有對檢測方法的穩(wěn)定性和靈敏度進行評估，本研究建立的檢測方法在綜合前人方法的基礎(chǔ)上開發(fā)出了一套新的檢測引物，實現(xiàn)了更好的擴增，提高了檢測穩(wěn)定性和靈敏度（圖1），且檢測靈敏度很高，稀釋105倍后仍能擴增出條帶（圖2）。

有關(guān)文心蘭組織快繁技術(shù)的報道很多[10，14，18]，但文心蘭脫毒處理方面的研究少有報道。朱根發(fā)等[10]報道的在檢測誘導(dǎo)出的文心蘭原球莖時均未發(fā)現(xiàn)病毒的原因可能是所選擇的實驗材料本身就是不攜帶病毒的，其研究內(nèi)容主要是組培技術(shù)，少有脫毒技術(shù)。病毒病是制約文心蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要因素，本研究首次在文心蘭脫毒種苗的生產(chǎn)中加入病毒A。組織培養(yǎng)至確定獲得無菌苗的第3代組培苗后，從繼代第4次時開始在培養(yǎng)基中分別添加0、5、10、15 mg/L病毒A，病毒A使用前經(jīng)滅菌的0.22 μm細菌過濾器過濾。隨著病毒A添加濃度的提高和轉(zhuǎn)接代數(shù)的增加，脫毒率不斷提高，但組培苗的枯死率也相對的增加（數(shù)據(jù)未顯示），不宜多代添加。本研究連續(xù)添加3代。用DAS-ELISA和RT-PCR檢測第6代組培苗的脫毒效果并統(tǒng)計原球莖的誘導(dǎo)與增殖情況。結(jié)果表明，病毒A濃度達到10 mg/L及以上時，所有陽性樣品組培苗用DAS-ELISA均未檢測到病毒，雙重RT-PCR檢測的脫毒率均達70%以上，且復(fù)合感染樣品檢測時兩種病毒均同時出現(xiàn)（表3）。但病毒A濃度達到15 mg/L時，增殖生長情況會受到一定程度的抑制（表2），表明高濃度的病毒A不利于文心蘭組培苗的增殖。筆者推薦病毒A的使用濃度為10 mg/L，在此基礎(chǔ)上結(jié)合病毒檢測技術(shù)，能有效生產(chǎn)出無毒文心蘭種苗。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)