張玉葉等

摘 要 應(yīng)用電子克隆技術(shù)，以煙草AAG59585序列為探針，獲得了甘蔗蘇氨酸脫氨酶（threonine deaminase）基因的全長cDNA，命名為ScTD。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增和驗(yàn)證，該基因序列與電子克隆結(jié)果一致性高達(dá)99%。序列分析結(jié)果表明：ScTD基因全長2 120 bp，具有完整的開放閱讀框（ORF，164～1 681 bp），編碼505個氨基酸，該基因編碼蛋白定位于微體，為可溶性蛋白，不存在信號肽，二級結(jié)構(gòu)原件多為α-螺旋，含有多個保守功能域，主要在氨基酸合成中發(fā)揮作用。電子表達(dá)分析結(jié)果顯示，該基因在甘蔗根尖、根頸、花序、葉片、全株、芽和莖中組成型表達(dá)，其中在花序和根中的表達(dá)量最高。熒光定量PCR結(jié)果分析表明：該基因在甘蔗各組織中均有表達(dá)，且在根中的表達(dá)量最高。此外，該基因的表達(dá)受水楊酸脅迫后表達(dá)量最高，約為對照組的43.16倍，其次為聚乙二醇和茉莉酸甲酯，分別為6.90倍和4.40倍，推測該基因的表達(dá)與甘蔗抗病蟲和抗?jié)B透脅迫有關(guān)。此結(jié)果為甘蔗ScTD基因的克隆和功能驗(yàn)證以及在甘蔗基因工程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 甘蔗；蘇氨酸脫氨酶基因；電子克??；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

中國分類號 S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Cloning and Expression Analysis of Threonine

Deaminase Gene in Sugarcane

ZHANG Yuye， HUANG Ning， SU Weihua， XIAO Xinhuan， LUO Jun， QUE Youxiong*

Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding， Ministry of Agriculture， Fujian Agriculture and Forestry University/

Sugarcane Research & Development Center， China Agriculture Research System， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract Using AAG59585 sequence from Nicotiana attenuata as the probe， the full-length cDNA sequence of one threonine deaminase gene termed as ScTD was cloned in silico from sugarcane（Saccharum Complex）. The sequence obtained from RT-PCR amplification had as high as 99% similarity with that from electronic cloning. The sequence analysis showed that the ScTD had a length of 2 120 bp containing an open reading frame（ORF， 164～1 681 bp）encoding 505 amino acids residues. The characters predicted based on the analysis of bioinformatics showed that the ScTD of sugarcane was a soluble acidic protein， which had two conserved functional domains with the main function for amino acid synthesis， and this protein was located in microbody. The main secondary structure element was α-helix. The electron expression analysis suggested that ScTD was constitutively expressed in different tissues of sugarcane， such as root tip， root collar， inflorescence， leaf， buds， whole plant and stem， especially higher in inflorescence and root. Real-time quantitative PCR（RT-qPCR）analysis revealed that the expression of ScTD in root was higher than that in other organs， while the inducible expression level of ScTD was apparent under the stresses of salicylic acid（SA）， polyethylene glycol（PEG）and methyl jasmonate（MeJA）， approximately 43.16 times， 6.90 times and 4.40 times that of control group respectively， which suggested that ScTD involves in the diseases and pest resistance and osmotic stresses in sugarcane. The results in this study will provide the basis of cloning and functional identification of other members of ScTD in sugarcane and promote the use of ScTD gene in sugarcane genetic engineering.

Key words Sugarcane； Threonine deaminase gene； In silico cloning； Bioinformatics； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.011

蘇氨酸脫氨酶（threonine deaminase，TD）也叫蘇氨酸脫氫酶（threonine dehydratase）。在植物和細(xì)菌中生物合成的蘇氨酸脫氨酶包含一個N端磷酸吡哆醛結(jié)合催化域和C端調(diào)控域，該酶在原核細(xì)胞及真核細(xì)胞中均可能與甘氨酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶（glycine C-acetyltransferase）結(jié)合成為復(fù)合物協(xié)同作用，將蘇氨酸轉(zhuǎn)化生成α-酮丁酸和氨，然后以α-酮丁酸為反應(yīng)物合成異亮氨酸，此途徑即為異亮氨酸合成的關(guān)鍵步驟[1]。L-異亮氨酸是合成人體激素、酶類的原料，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抑制其分解的效果，在人體生命活動中起著重要作用，在食品和醫(yī)藥行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用及商業(yè)價值[2]。蘇氨酸脫氨酶受異亮氨酸的負(fù)反饋調(diào)控[3]。目前，該酶在大腸桿菌、鼠傷寒桿菌、谷氨酸棒桿菌等[4-5]細(xì)菌中已有報(bào)道。在植物中，蘇氨酸脫氨酶與植物抗蟲有關(guān)，分別在番茄等茄科植物[6]，煙草[7]中有相關(guān)報(bào)道，但在甘蔗中尚未見有關(guān)蘇氨酸脫氨酶的報(bào)道。

電子克隆（in silico cloning）是通過EST或基因組的序列組裝和拼接，快速地獲得目標(biāo)基因部分或全長cDNA序列的技術(shù)。該技術(shù)在人、鼠和水稻等[8-9]EST豐富的模式生物中首先得到運(yùn)用，隨后在植物中運(yùn)用此技術(shù)獲得新基因的報(bào)道日益增加，此技術(shù)在甘蔗中也得到了有效利用[10-11]。電子表達(dá)分析是通過某物種特定基因所有相關(guān)表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tag，EST）的整合分析，從而獲得該基因表達(dá)相關(guān)信息的一種新型基因表達(dá)分析技術(shù)。目前，電子表達(dá)分析與電子克隆技術(shù)結(jié)合起來挖掘新基因和分析基因功能已被成功應(yīng)用于包括甘蔗等多種植物目標(biāo)基因的表達(dá)分析[12]。本研究以甘蔗為材料，電子克隆與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合獲得甘蔗蘇氨酸脫氨酶基因，并對其功能進(jìn)行探討，為異亮氨酸的生產(chǎn)以及研究該基因在甘蔗抗逆性中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗品種新臺糖22號（ROC22）由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑 PrimeScriptTM RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR R Green PCR Master Mix Kit （Roche）均購自大連寶生物（TaKaRa）公司。

1.2 方法

1.2.1 植物材料處理 從田間選取3株健康、長勢一致的ROC22植株，整株取回。將根部的泥土洗凈，選取白色的幼根作為材料。用于組織表達(dá)的材料為甘蔗第七或第八節(jié)，分別取蔗芽，蔗皮，蔗髓，第一片葉的葉片和葉鞘。研究目的基因受不同外源脅迫后的表達(dá)特性時，將ROC22蔗莖作為種莖，砍成單芽莖段后，采用沙培法，在塑料大棚中育苗至其長出第四或第五葉。選取長勢一致的蔗苗水培1周，分為對照和4種脅迫組，每組每個時間點(diǎn)均設(shè)3株蔗苗，作為生物學(xué)重復(fù)。脅迫組處理?xiàng)l件為水楊酸（salicylic acid，SA）（5 mmol/L）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）（100 μmol/L）、脫落酸（abscisic acid，ABA）（100 μmol/L）、模擬干旱（PEG8000）（25.0%），每1 h噴撒葉面1次，未處理的蔗葉作為對照。分別取6 h后各小組內(nèi)3棵蔗苗的蔗葉。以上所有植物材料均立即投入-80 ℃液氮中保存，備用。

1.2.2 電子克隆獲得基因序列 以煙草TD基因（AAG59585）蛋白序列作為探針，運(yùn)行NCBI的tblastn檢索甘蔗EST數(shù)據(jù)庫，獲得與之相似的甘蔗EST序列群，用BioEdit中的contig assembly program（CAP）（http：//pbil. univ-lyon1.fr/cap3.php）軟件拼接組裝為重疊群（contig），獲得組裝全長cDNA序列的EST候選清單。然后以最終拼好的contig重疊群為新探針，再次進(jìn)行搜索，直到?jīng)]有新的甘蔗EST可供拼接為止。最后利用NCBI的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）服務(wù)器，對最終所獲得的cDNA序列進(jìn)行開放閱讀框分析并進(jìn)行翻譯。

1.2.3 甘蔗TD基因的RT-PCR及測序 采用Trizol法提取甘蔗ROC22葉片的總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為PCR的模板。以上述電子克隆獲得的cDNA 序列為模板，設(shè)計(jì)一對特異性RT-PCR擴(kuò)增引物，5′端引物（5′-TGCCCGTGACAA

CGCCAGAA-3′）和3′端引物（5′-GGTGCCGCAAACC

GATAAA-3′）。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×GC Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，引物（20 μmol/L）各1.0 μL，Ex Taq酶0.2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 17.3 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用Gel Extraction Kit對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，并與pMD-19T載體連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在抗性Ampr的LB平板上篩選陽性克隆，隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽性單菌落菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4 甘蔗ScTD基因序列的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy中ProtParam pI/Mw（http：//web.expasy.org/compute_pi/）在線工具對序列的理化性質(zhì)、氨基酸組成等一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號肽分析，ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測，Profun 2.2 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）進(jìn)行功能預(yù)測，編碼蛋白亞細(xì)胞定位用Psort（http：//www.psort.org/）在線工具預(yù)測，GOR IV（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，Blast上查找氨基酸同源性序列。

1.2.5 甘蔗ScTD基因的電子表達(dá)分析 根據(jù)植物EST序列組織來源或脅迫材料的來源不同，進(jìn)行電子表達(dá)分析，分析該基因組織特異性表達(dá)或生物、非生物脅迫后表達(dá)特性[12]。

1.2.6 甘蔗ScTD基因的熒光定量PCR分析 采用Trizol 法提取ROC22葉片、葉鞘、側(cè)芽、蔗皮、蔗髓、根及經(jīng)SA、MeJA、ABA、PEG脅迫處理和對照組ROC22葉片的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量PCR模板，以25 S rRNA作為內(nèi)參基。合成熒光定量引物5′端引物（5′-TGC

AATGGCATTATCCTTGT-3′）和3′端引物（5′-TGACA

GCTACACCATCAGCA-3′），25S rRNA的5′端引物（5′-TGCTTTGCTCGGTTTATAGC-3′）和3'端引物（5′-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3′）[13]。按照SYBR R Green PCR Master Mix Kit（Roche）說明書配置定量反應(yīng)體系。熒光定量PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45個循環(huán)，設(shè)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DNAMAN軟件，將重組質(zhì)粒序列與電子克隆序列進(jìn)行同源性比對。并用DNAMAN軟件分析氨基酸同源性及多序列比對，完成并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。在Excel工作表中采用 2-△△CT算法[14-15]分析熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，畫圖并計(jì)算3次重復(fù)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗ScTD基因的獲得

電子克隆得到一個全長為2 120 bp的基因序列（圖1），該cDNA序列具有完整的開放閱讀框（ORF，164～1 681 bp），編碼505個氨基酸，說明此序列為一條完整的甘蔗蘇氨酸脫氨酶基因的cDNA序列，命名為ScTD。

經(jīng)過RT-PCR 擴(kuò)增獲得了約1 400 bp的單一條帶（圖2），經(jīng)克隆與測序，證實(shí)其序列與電子克隆所獲得的序列一致性達(dá)到99%，僅有14個堿基不同，經(jīng)推測可能是在PCR擴(kuò)增時堿基錯配造成的。因此，推測電子克隆所獲得的甘蔗ScTD基因序列是正確的。

2.2 甘蔗ScTD基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 甘蔗ScTD基因編碼氨基酸的一級結(jié)構(gòu)預(yù)測

甘蔗ScTD基因編碼氨基酸進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果見表1。

2.2.2 甘蔗ScTD蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析 結(jié)果見表2。表2顯示，α-螺旋所占的比例最高為45.64%，其次是無規(guī)則卷曲占37.15%和最低的延伸鏈占比例17.19%。

2.2.3 甘蔗ScTD蛋白信號肽預(yù)測和分析 結(jié)果見表3所示。第48位苯丙氨酸殘基具有最高的原始剪切位點(diǎn)分值0.126和最高的信號肽分值0.109，第24 位丙氨酸殘基具有最高的綜合剪切位點(diǎn)分值0.131。由于最后算得氨基酸殘基的加權(quán)平均值較小，為0.103（遠(yuǎn)遠(yuǎn)<0.5），則推測ScTD基因所編碼的蛋白不存在信號肽，而為非分泌蛋白，說明該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成后，不能進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.2.4 甘蔗ScTD蛋白疏水性/親水性的預(yù)測和分析

由圖3可知，第185位具有最高分值，為2.300，疏水性最強(qiáng)；第361位和第499位具有最低分值，為-2.322，親水性最強(qiáng)。整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，沒有明顯的疏水區(qū)，故推測甘蔗ScTD蛋白是一種親水蛋白。

2.2.5 甘蔗ScTD蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 ScTD蛋白的空間結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和螺旋為主（圖4）。比較甘蔗、高粱、玉米和水稻中TD蛋白的三級空間結(jié)構(gòu)虛擬圖，結(jié)果顯示，甘蔗的三級空間結(jié)構(gòu)與高粱、玉米和水稻蛋白的三級空間結(jié)構(gòu)高度相似。 2.2.6 甘蔗ScTD蛋白的功能預(yù)測 該蛋白的最主要功能為氨基酸生物合成，也有一定可能性參與了輔酶因子生物合成、翻譯能量代謝及脂肪酸代謝（表4）。由于蘇氨酸脫氨酶是異亮氨酸合成的關(guān)鍵酶之一，則預(yù)測結(jié)果與實(shí)際相符。

2.2.7 甘蔗ScTD蛋白的亞細(xì)胞定位 甘蔗ScTD蛋白可能定位于微體的過氧化酶體中（表5）。

2.2.8 甘蔗ScTD蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析 如圖5所示，甘蔗ScTD蛋白包含2個保守結(jié)構(gòu)域，分別為Trp-synth-bete_ⅡSuperfamily和ACT Superfamily。這和前文所提到此基因在植物和細(xì)菌中N端和C端的結(jié)構(gòu)特征相符[1]。

2.2.9 甘蔗ScTD蛋白的氨基酸同源性分析 對甘蔗ScTD蛋白的氨基酸進(jìn)行同源性分析。在結(jié)果中選擇高粱（Sorghum bicolor_gb|XP_002466574.1|）、玉米（Zea mays_gb|DAA51003.1|）、水稻（Oryza sativa Japonica Group_gb|AAL 58211.1|）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon_gb|XP_003559531.1|）、番茄（Solanun lycopersicum_gb|NP_ 001234234.1|）、毛楊果（Populus trichocarpa_gb|XP_002326230.1|）和黃瓜（Cucumis sativus_gb|XP_004143291.1|）進(jìn)行分析，蛋白的氨基酸序列相似性分別為98%、96%、94%、88%、80%、80%和76%。

從圖6可以看出，同屬單子葉植物的甘蔗和高粱同源性最高。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示（圖7）：單子葉植物甘蔗、玉米、水稻和二穗短柄草為一分支，同屬雙子葉植物的番茄、黃瓜和毛楊果為另一分支。因此，該基因在不同物種間具有很強(qiáng)的保守性，它們對應(yīng)的蛋白屬于同一個家族。

2.3 甘蔗ScTD基因的表達(dá)分析

2.3.1 甘蔗ScTD基因的電子表達(dá)分析 電子表達(dá)分析結(jié)果見圖8。圖8顯示，甘蔗ScTD基因在甘蔗根尖、根頸、花序、葉片、莖、全株和芽中組成型表達(dá)，其中在花序中的表達(dá)量比其他類型組織表達(dá)量高。此外，該基因的表達(dá)受葡萄糖桿菌調(diào)控。

2.3.2 甘蔗ScTD基因的熒光定量PCR表達(dá)分析

分析甘蔗ScTD基因在不同組織中的表達(dá)，結(jié)果見圖9所示。由圖9可知，該基因在不同組織中均有表達(dá)，在蔗髓中表達(dá)量最少；其次是芽中；根中表達(dá)量最高，是蔗髓中的51.02倍，是芽中表達(dá)量的10.87倍。分析甘蔗ScTD基因在不同脅迫下的應(yīng)答反應(yīng)，結(jié)果見圖10。由圖10可知，該基因在不同脅迫下的相對表達(dá)量呈上調(diào)趨勢，其中在水楊酸脅迫下的相對表達(dá)量最高，為對照組的43.16倍，其次是在聚二乙醇和茉莉酸甲酯脅迫下的表達(dá)量，分別為6.90和4.40倍。推測該基因表達(dá)與甘蔗的抗病性和滲透有關(guān)，與前人的報(bào)道相符[6-7]。

3 討論與結(jié)論

本研究采用電子克隆與實(shí)驗(yàn)克隆相結(jié)合的方法，成功地克隆了甘蔗ScTD基因，重組子序列與電子克隆序列同源性高達(dá)99%，推測本研究電子克隆所獲得的序列是正確的，進(jìn)一步證明電子克隆與實(shí)驗(yàn)克隆相結(jié)合是發(fā)現(xiàn)新基因的有效途徑。而后，采用多種生物信息學(xué)手段分析了該基因的特性，甘蔗ScTD基因在不同物種間具有較強(qiáng)的保守性，不同物種相應(yīng)的蛋白同源序列均達(dá)到80%左右。所編碼的蛋白位于微體，為親水、非分泌酸性蛋白，在調(diào)控異亮氨酸的生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究利用Unigene數(shù)據(jù)庫分析了甘蔗蘇氨酸脫氨酶基因的電子表達(dá)，檢索到22條同源性較高的EST序列，甘蔗EST數(shù)據(jù)庫中包含了283 951條EST，已經(jīng)能夠非常好地覆蓋了甘蔗的全基因組，此結(jié)果能夠如實(shí)反映該基因在甘蔗基因組中的表達(dá)情況。電子表達(dá)分析結(jié)果顯示，該基因在花序和根中都有很高的表達(dá)量，這與熒光定量PCR結(jié)果大體一致，都是在根中相對表達(dá)量高，說明電子表達(dá)分析技術(shù)可以用于甘蔗中目的基因的表達(dá)分析，這與本課題組以往的的研究結(jié)果一致[12]。

水楊酸（SA）在超敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）中能介導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的氧化迸發(fā)（oxidative burst），誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related protein，PR）基因的表達(dá)，引發(fā)系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）的產(chǎn)生，并且能誘導(dǎo)一些防衛(wèi)基因（如PR）的激活或表達(dá)[16]。PEG為一種理想的模擬滲透脅迫物質(zhì)[17]。茉莉酸和茉莉酸甲酯能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對害蟲有毒、抗?fàn)I養(yǎng)和抗消化作用的化合物，對害蟲生理活動產(chǎn)生不利影響[18]。本文通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)對甘蔗ScTD基因在不同組織和不同脅迫下的相對表達(dá)量行進(jìn)分析。不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果顯示，該基因在蔗髓、蔗皮、側(cè)芽、葉片、葉鞘和根中都有表達(dá)，其中在根中的相對表達(dá)量最高，芽次之。在SA、ABA、MeJA和PEG等脅迫下的表達(dá)分析結(jié)果顯示，該基因在本實(shí)驗(yàn)所有脅迫下均上調(diào)表達(dá)，其中SA脅迫下的相對表達(dá)量最高，PEG和MeJA脅迫下的表達(dá)量次之。有研究結(jié)果表明，氨基酸合成所需的氮素主要來源于大氣和土壤，根吸收土壤中的硝酸鹽，以此來進(jìn)行氮代謝[19]，而蘇氨酸脫氨酶是合成異亮氨酸關(guān)鍵酶之一，主要作用為氨基酸的合成，這可能是該基因在根中表達(dá)量會相對其他組織要高的原因。芽的生長發(fā)育需要較多氨基酸，推測這是蘇氨酸脫氨酶在芽中相對含量較高的原因。因此，本研究推測蘇氨酸脫氨酶基因與甘蔗的抗病蟲和抗?jié)B透脅迫存在一定的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，本研究采用電子克隆與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法成功克隆到甘蔗ScTD基因，并進(jìn)行了該基因的生物信息學(xué)分析、電子表達(dá)分析和熒光定量PCR分析。研究結(jié)果為甘蔗中ScTD基因功能的深入解析及其應(yīng)用積累了基礎(chǔ)資料。

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責(zé)任編輯：趙軍明