蘇慧慧等

摘 要 2012～2013年，于廣州地區(qū)采集番茄青枯病病樣并進行病原分離工作，經(jīng)分子鑒定后獲得9個菌株。通過PCR擴增獲得了其中9個菌株的egl基因序列，采用國際新興的青枯菌演化型分類框架進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以NCBI數(shù)據(jù)庫中分離自不同寄主的青枯菌菌株egl基因序列為參考序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果表明：9個菌株屬于青枯菌演化型I型即亞洲分支菌株的4個序列變種，分別為序列變種13、14、34、44。以高抗青枯病番茄材料‘興農(nóng)021和敏感材料‘金冠3號為試材，評價了其中5個菌株的致病力，結(jié)果表明3-1和18-6致病力較高。

關鍵詞 青枯病菌；番茄；分子鑒定；致病力分析

中圖分類號 S432.4 文獻標識碼 A

Abstract To provide theoretic guidance to disease-resistant breeding， a new phylotype classification schemes and pathogenicity determination to investigate Ralstonia solanacearum strains of tomato was used. The result of phylotype-specific PCR with 759/760 primers showed that the specific 281 bp fragment of Ralstonia solanacearum strains was amplified from all 9 isolates. The egl gene fragments of the 9 strains were amplified by PCR using the universal primer Endo-F/R with a 750 bp fragment， phylogenetic analysis examined the partial sequence of the egl gene of 9 isolates and 29 reference strains， the result showed that all of the 9 isolates were belonged to phylotype I. Five isolates was used for the pathogenicity tests by the methods of cutting and soaking roots with 108 cfu/mL， 3-1 and 18-6 was the high virulent strains under the highly resistant varieties ‘Xingnong 021 and sensitive varieties ‘Jinguan 3.

Kew words Ralstonia solanacearum；Tomato；Phylotype identification；Pathogenicity determination

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.031

番茄（Solanum Lycopersicum）是世界上重要的經(jīng)濟作物和模式植物之一[1]。由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum Simth）侵染引起的青枯病（Bacterial wilt）是嚴重影響番茄產(chǎn)量的重要細菌性病害[2]，在中國南方番茄產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，其中以廣東、廣西、福建、臺灣、海南危害最為嚴重[3]。青枯菌菌系復雜，且具有廣泛的寄主，可侵染54個科的400多種植物[4]，其中番茄、煙草、馬鈴薯、茄子、花生等受害最為嚴重[5-7]。

青枯菌群體在不同地區(qū)和寄主來源等具有高度的變異性及適應性，且表現(xiàn)出生理分化和菌系多樣性[7]。Prior等[8]提出并建立了依次將青枯菌劃分為種（Species）、演化型（Phylotype）、序列變種（Sequevar）及克?。–lone）4個不同水平分類單元的分類框架，根據(jù)地理起源密切相關將演化型分為演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型，其中來自亞洲的生化變種3、4和5歸為演化Ⅰ型，美洲的生化變種1、2和2T為演化Ⅱ型，來自非洲的生化變種1和2T為演化Ⅲ型，印度尼西亞的生化變種1、2、2T為演化Ⅳ型。序列變種是以內(nèi)切葡聚糖酶基因（endoglucanase，egl）進行系統(tǒng)發(fā)育分析時，一組序列高度保守的菌株集合體。國際上已經(jīng)鑒定出51個序列變種，目前主要危害中國青枯菌分屬演化型Ⅰ和Ⅱ，以及1、12、13、14、15、16、17、18、34、44和48等11個序列變種[4]。該方法可精確反映青枯菌的地理起源及種內(nèi)遺傳多樣性。

目前，番茄青枯病的防治主要通過選育高抗品種、農(nóng)業(yè)措施、化學藥劑和生物農(nóng)藥等方法[3]，其中生物防治得到了廣泛的關注[9-10]。然而，青枯菌的小種多樣性以及與寄主、環(huán)境之間復雜的互作，使得抗青枯病的育種十分困難[2]。本研究的目的是分離并開展廣州地區(qū)番茄青枯菌系統(tǒng)發(fā)育分析及致病力評價。通過特異引物的PCR擴增和測序，對番茄發(fā)病植株的青枯菌進行分離、純化、鑒定與檢測其致病性，為番茄青枯病的防控工作及番茄的抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1 材料

青枯菌病樣采集的番茄品種和來源見表1；TTC和NB培養(yǎng)基配方參照徐進等[11]的研究方法，培養(yǎng)基所用藥品均購自鼎國生物公司；PCR擴增所用rTaq和dNTP購自Takara；膠回收試劑盒購自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株的采集與分離 2012～2013年從廣東省農(nóng)科院大豐基地和鐘落潭基地采集266F1、Y18、齊達利、艾美瑞、L35BD、NEW105等9份番茄抗青枯病敏感材料的發(fā)病植株地上部10 cm莖段樣品，室內(nèi)切片，對在顯微鏡下觀察有細菌溢膿現(xiàn)象的材料，參照徐進等[11]青枯菌分離純化方法獲得純化菌株，于4 °C冰箱內(nèi)斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 供試菌株的分子生物學鑒定 采用簡易提取法[12]提取青枯病菌菌株的基因組DNA，以用于實驗的模板。

參照Prior等[8]的研究方法，采用青枯菌特異引物759-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC和760-GTCGCC

GTCAGCAATGCGGAATCG鑒定青枯菌。序列變種鑒定引物Endo-F-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC和Endo-R-GCGTTGCCCGGCACGAACACC用于擴增egl基因序列。所用引物由上海英駿生物公司合成。

PCR擴增體系和程序參照潘哲超等[7]的研究方法，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，參照試劑盒說明書進行回收后送生工生物（上海）股份有限公司，用引物Endo-F進行序列測序。

1.2.3 供試菌株的致病力鑒定 參照何自福等[12]的研究方法，選取經(jīng)測序鑒定的青枯菌18-1、17-2、18-6、3-1、2-6菌株，在TTC 平板上活化培養(yǎng)48 h 后，挑取中間呈淺粉紅色、邊緣乳白色的菌落于NB液體培養(yǎng)基（蛋白凍10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，定容至1 000 mL， pH值7.4），30 ℃，200 r/min培育24 h，調(diào)節(jié)細菌濃度為1.0×108 cfu/mL，采用浸根接種法，將4～5葉期番茄幼苗從育苗盤中拔出，沖洗凈根部土壤，在青枯菌菌液中浸泡20 min，然后移栽于裝有滅菌土的塑料盆中，每個處理3次重復，每個重復30株。后續(xù)水肥按常規(guī)管理。接種后每7 d調(diào)查1次，統(tǒng)計發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄青枯菌菌株的分離和分子鑒定

2012～2013年從田間番茄發(fā)病植株中分離得到9株分離物（表1），各菌株在TTC平板培養(yǎng)48 h后，菌落經(jīng)劃線培養(yǎng)后具有流動性，中央呈粉紅色，外緣為乳白色，形狀不規(guī)則（圖1）。

分離自番茄發(fā)病植株的9個菌株經(jīng)青枯菌特異引物759/760均可擴增得到0.3 kb的片段，說明此9個菌株為青枯菌；其中9個菌株經(jīng)egl引物擴增可得到750 bp的片段，經(jīng)測序獲得egl基因序列并獲得NCBI登錄號（KJ913687-KJ913695）。

2.2 番茄青枯菌菌株egl基因系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI中檢索并下載不同演化型及序列變種的青枯菌菌株egl基因序列（表2），并以此為參考，比對分析待測菌株的測序結(jié)果，進行進化樹分析，結(jié)果見圖2。所有待測菌株均屬于PhylotypeⅠ型的序列變種，且待測菌株與已知序列變種序列比對為100%，其中菌株2-6與O3，17-2與Zo4，3-1、3-3、3-5與PSS219，18-1、20-3、18-10與JT523，18-6與PSS81聚類在一起；其中NEW105分離的青枯菌分屬于序列變種13（18-1、18-10）和14（18-6），即相同品種分離得到不同青枯病菌株，田間番茄青枯病是由多個不同的青枯菌菌株復合侵染造成的。

2.3 番茄青枯菌菌株的致病力評價

以番茄高抗材料興農(nóng)021，敏感材料金冠3號為試材，選取分離自不同番茄病樣的5個菌株進行致病力評價，結(jié)果見圖3。感病品種金冠3號接種各測試菌株21 d后發(fā)病率超過50%，在抗病品種興農(nóng)021接種測試菌株3-1和18-6 28 d后超過20%，接種試驗數(shù)據(jù)表明測試菌株3-1和18-6為高致病力菌株。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)青枯菌鑒定方法從分離純化到生化鑒定，一般需1～2周時間完成，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫熒光抗體染色（IF）、DNA探針、PCR等技術(shù)的發(fā)展加快了對青枯菌檢測的靈敏度和時效性[3]。國內(nèi)外學者根據(jù)青枯菌hrp基因和16S rDNA序列差異設計引物在馬鈴薯、煙草、番茄、香蕉等作物快速、準確分離鑒定青枯菌方面開展了大量研究工作[5，6-7，12-13]。Opina等[14]研究發(fā)現(xiàn)一對青枯菌特異引物759/760，并成為在番茄、辣椒、煙草、馬鈴薯等[11，15-17]多種作物分離青枯菌菌株的快速特異的檢測手段；本研究分離得到的9個青枯菌分離物均具有利用759/760特異引物擴增得到281 bp的條帶，說明其均為青枯菌菌株。

青枯菌與寄主的協(xié)同進化過程中，演化出明顯的生理及致病力分化特征[7]。Prior等[8]在傳統(tǒng)分類方法研究的基礎上提出種、演化型、序列變種和克隆的演化型分類框架，在序列變種構(gòu)建系統(tǒng)進化樹過程中，菌株的內(nèi)切葡聚糖酶基因egl或hrpB等核心基因序列同源性大于99%即可認定為同一序列變種[4]。Xu等[18]基于演化型分類框架對國內(nèi)13個省、17種不同寄主植物上的286個青枯菌株的研究發(fā)現(xiàn)中國青枯菌種內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性，對來自廣東廣州（序列變種44）、廣西（序列變種14）、湖北（序列變種15）和四川（序列變種44）各1份、福建8份（13、14、15、16、17、18、44）共計12份番茄青枯病菌分屬6個序列變種。潘哲超等[7]通過對福建及貴州62個煙草青枯菌系統(tǒng)發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)其均屬于亞洲分支的4個序列變種（15、17、34、44），其中15和17為優(yōu)勢菌系。本研究對廣州大豐和鐘落潭地區(qū)的番茄青枯病菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，9個待測菌株均屬于演化I型的4個序列變種（13、14、34和44）；其中分離自廣州大豐Y18中3個菌株（3-1、3-3、3-5）均與序列變種34的標準菌株臺灣番茄青枯病菌株PSS219一致，2-6與廣西油橄欖O3序列變種44一致；分離自廣州鐘落潭的NEW103的18-6與序列變種14的標準菌株臺灣番茄青枯病菌株PSS81一致，而18-1、18-10和20-3為留尼旺島馬鈴薯JT523序列變種13一致。由于本研究供試菌株較少，且采集地點為廣州市，僅能部分印證和補充前人研究結(jié)果，青枯病是南方地區(qū)番茄生產(chǎn)的主要限制因素，而基于新的演化型分類框架的序列變種與國內(nèi)其他番茄主產(chǎn)區(qū)之間的對應關系需進一步研究。

本研究進一步對4個序列變種的5個菌株進行致病力分析，結(jié)果表明，不同菌株致病力差異較大，其中菌株18-6和3-1致病力較強。由于番茄青枯病一般為開花和坐果期發(fā)病，造成嚴重的經(jīng)濟損失，且青枯菌群具有高度的適應性和變異性，因此開展青枯菌的系統(tǒng)發(fā)育及序列變種的致病性評價對指導番茄抗青枯病育種進程有重要意義。

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