馬德慧　薛江東　楊鳴霞　姚睿智　商祥軍

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome ， PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）引起的豬的一種急性熱性接觸性傳染病，該病主要特征是厭食、發(fā)熱，懷孕母豬中后期發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎，木乃伊胎；幼齡仔豬發(fā)生呼吸道癥狀和大量死亡。該病最早于1987年在美國發(fā)現(xiàn)[1]。荷蘭學(xué)者Wensvoort G等在1990年底首次從人工和自然感染的病豬中分離到該病毒， 并將其命名為Lelvstad virus （LV）。1992年，世界動物衛(wèi)生組織（Office Inlernalional Des Epizoolies，OIE）在國際專家研討會上采用了PRRS這一名稱[2]。我國于1996年由郭寶清等首次從國內(nèi)疑似PRRSV感染豬群中分離出PRRSV，從而證實該病在我國的存在[3]。2006年夏季，“豬高熱綜合征”在我國南方地區(qū)首先發(fā)生并流行，然后迅速波及全國大部分養(yǎng)豬地區(qū)[4]。2007年1月，經(jīng)過國內(nèi)許多專家學(xué)者的不斷研究，最后確定了引起國內(nèi)“豬高熱綜合征”的主要病原是PRRSV變異株，并將這種由PRRSV變異株引起的疾病命名為豬高致病性藍(lán)耳病（HP-PRRS）。近幾年，PRRSV不斷變異，出現(xiàn)了毒力更強的PRRSV變異株，嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，由于尚無特效的藥物療法，所以疫苗研制就成為熱點問題之一。

1 PRRS滅活疫苗

目前我國使用的商品化PRRS滅活疫苗主要由NVDGJ XAI株和CH-la株滅活制成的，臨床實踐表明滅活疫苗的免疫保護(hù)效果良好。周建勝等對來自山東省接種PRRS滅活疫苗的豬場進(jìn)行PRRSV特異性抗體檢測[5]。發(fā)現(xiàn)接種過PRRS滅活疫苗的豬場，PRRSV的特異性抗體水平均較高，達(dá)到56.4%～87.9%。郭寶清等選用豬繁殖與呼吸綜合征CH-1a株，在Marc 145細(xì)胞上增殖了較高滴度后制成PRRS油佐劑滅活疫苗，經(jīng)過免疫效力試驗和攻毒試驗發(fā)現(xiàn)，用該疫苗免疫過的豬，體內(nèi)抗體在20 d左右達(dá)到高峰，并能維持半年左右，說明該疫苗的免疫保持期較長[6]。王星晨等利用豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）安徽分離株制備了油乳劑滅活疫苗，用該疫苗免疫豬，7 d后便能夠產(chǎn)生抗體，14 d后血清抗體水平達(dá)到高峰，免疫28 d以后使用強毒進(jìn)行攻擊，保護(hù)力可達(dá)80%[7]。

盡管滅活疫苗有較好的免疫效果，但存在免疫劑量大、免疫次數(shù)多、免疫產(chǎn)生周期長、對異源株免疫保護(hù)效果差等缺點[8]。Nilubol等報道，用PRRS滅活疫苗免疫仔豬后，攻毒不能保護(hù)仔豬對PRRSV的感染，病毒感染后病毒血癥的持續(xù)時間和病毒的滴度與非免疫組無顯著差別，但是能增加中和抗體的效價和產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)[9]。由此看出PRRS滅活疫苗并不能夠適應(yīng)PRRSV具有很強變異性這一特點，所以單獨使用PRRS滅活疫苗來預(yù)防PRRS的發(fā)生和流行是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的[10，11]。

2 PRRS弱毒疫苗

弱毒疫苗是用微生物產(chǎn)生的自然強毒或從自然界篩選的自然弱毒株通過人工致弱而制成的。盡管弱毒疫苗在制作過程中毒力被減弱，但是病原仍可在免疫動物體內(nèi)進(jìn)行繁殖，所以弱毒疫苗具有用量小，免疫原性好，免疫期長，成本低等優(yōu)點。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)接種過PRRS弱毒疫苗的仔豬對抗PRRSV感染的能力要強于接種PRRS滅活疫苗的仔豬。劉海珍等研究表明，首次免疫和加強免疫均用高致病性豬藍(lán)耳病滅活疫苗，抗體保護(hù)率只有30～40%；而首次免疫用高致病性豬藍(lán)耳病弱毒疫苗，加強免疫用高致病性豬藍(lán)耳病滅活苗或弱毒疫苗，免疫保護(hù)率能達(dá)到80%以上[12]。

目前我國國內(nèi)使用的PRRS弱毒疫苗毒株主要有R98株、CH-1R株、HuN4-F112株、JXA1-R株等。冷雪等用高致病性PRRSV致弱株TJM制備弱毒疫苗，安全性試驗表明該疫苗對4～5周齡仔豬安全，攻毒試驗表明疫苗接種豬對強毒攻擊的保護(hù)率達(dá)到80%（4/5）以上，保存期試驗顯示該疫苗易于保存[13]。李惠蘭等用JXAI-R株、TJM-F92株、HUN4-F112株3個毒株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗對豬進(jìn)行免疫試驗[14]。1個月后抗體檢測顯示合格率均達(dá)到100%；3個月后再次進(jìn)行抗體檢測，合格率仍可保持在80%～100%之間，說明這3個毒株疫苗均可以產(chǎn)生較好的免疫效果。徐小艷等對PRRS活疫苗（JXA1-R株）進(jìn)行了試驗，疫苗的安全性試驗和普免試驗表明該疫苗用于3～4周齡仔豬是安全的，且免疫效果良好[15]。

盡管PRRS弱毒疫苗對PRRSV的感染能起到一定的保護(hù)作用，但是，弱毒疫苗在使用過程中同樣存在著一些缺點。有報道稱PRRSV可以通過母體胎盤感染給胎兒，如果母豬在懷孕期間接種了PRRS弱毒疫苗，那么很有可能產(chǎn)下帶有PRRSV的小豬；另外，有些接種過PRRS弱毒疫苗的公豬精液中也可以分離到病毒。Nielsen J等使用從胎兒、死胎及死亡的仔豬中分離到的疫苗源毒人工感染懷孕晚期的母豬，發(fā)現(xiàn)人工分離到的疫苗源毒能在豬群當(dāng)中持續(xù)存在，并且引發(fā)疾病[16]。由此看來應(yīng)該謹(jǐn)慎使用PRRS弱毒疫苗。

3 生物技術(shù)疫苗

生物技術(shù)疫苗是利用生物技術(shù)制備的分子水平的疫苗。目前，PRRS生物技術(shù)疫苗主要有基因工程亞單位疫苗和活載體疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗等。

3.1 基因工程亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗是用DNA重組技術(shù)，將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因?qū)朐思?xì)胞（如大腸桿菌）或真核細(xì)胞（如雞胚成纖維細(xì)胞，CHO細(xì)胞），使其在受體細(xì)胞中高效表達(dá)，分泌保護(hù)性抗原肽鏈。提取保護(hù)性抗原肽鏈，加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗，又稱為生物合成亞單位疫苗。這種基因工程亞單位疫苗，只含有產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答所必需的免疫原成分，不含有免疫所不需要的成分，因此有很多優(yōu)點。首先，是安全性好，疫苗中不含傳染性材料，接種后不會發(fā)生急性、持續(xù)或潛伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情況，如妊娠母豬；其次，這些疫苗減少或消除了常規(guī)活疫苗或死疫苗難以避免的致熱原、變應(yīng)原、免疫抑制原和其他有害的反應(yīng)原。

Jianzhong Hu等用玉米的愈傷組織表達(dá)了PRRSV的M蛋白，并將其口服給小鼠，結(jié)果表明該病毒蛋白可以引起小鼠的體液免疫應(yīng)答并且產(chǎn)生了具有病毒中和活性的IgG和IgA抗體；除此之外，在接種動物的脾細(xì)胞還檢測到PRRSV特異性的

IFN-γ[17]。這些結(jié)果表明利用轉(zhuǎn)基因玉米來生產(chǎn)PRRS口服亞單位疫苗是非常有潛力的。錢洪喜等將構(gòu)建的pPIC9K-NA和pPIC9K-NE重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入到酵母宿主細(xì)胞GS115中進(jìn)行蛋白表達(dá)試驗[18]。SDS-PAGE結(jié)果顯示，表達(dá)出來的兩種產(chǎn)物大小均約為15 kD，Dot blot結(jié)果表明表達(dá)的兩種N蛋白可以與各自對應(yīng)的陽性血清發(fā)生反應(yīng)，這說明N蛋白具有較好的反應(yīng)原性。Plana等把PRRSV的ORF2-ORF7基因分別插入到桿狀病毒表達(dá)載體內(nèi)，結(jié)果只有ORF2、ORF3 、ORF5和ORF7在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，將ORF3和ORF5基因的表達(dá)產(chǎn)物提取后免疫懷孕母豬，結(jié)果顯示，ORF3基因的表達(dá)產(chǎn)物保護(hù)率為68.4%，ORF5基因的的表達(dá)產(chǎn)物保護(hù)率為50%[19]。

3.2 基因工程疫苗

基因工程疫苗包括活載體疫苗和基因缺失疫苗二類。

3.2.1 活載體疫苗

活載體疫苗是用基因工程技術(shù)將病毒或細(xì)菌構(gòu)建成一個載體，然后把外源基因插入其中使之表達(dá)的活疫苗。該類疫苗免疫動物后向宿主免疫系統(tǒng)提交免疫原性蛋白的方式與自然感染時的真實情況很接近，可誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫比較廣泛，包括體液免疫和細(xì)胞免疫，甚至黏膜免疫，所以可以避免重組亞單位疫苗的很多缺點。如果載體中同時插入多個外源基因，就可以達(dá)到一針防多病的目的。

仇玉等以雞痘病毒為載體構(gòu)建了重組有PRRSV免疫原性基因的重組雞痘病毒疫苗rFPV-GP5，rFPV-M和rFPV-GP5-M，結(jié)果顯示，小鼠在接種重組雞痘病毒兩周后體內(nèi)可產(chǎn)生PRRSV特異性抗體，并且使用rFPV-GP5-M免疫的小白鼠體內(nèi)中和抗體滴度明顯高于用rFPV-M和rFPV-GP5蛋白免疫組；另外，rFPV-GPS-M可以顯著促進(jìn)小鼠T細(xì)胞的增殖和IFN-γ的分泌，這說明重組雞痘病毒rFPV-GP5-M能夠引起機體的體液免疫和細(xì)胞免疫，并且效果良好，具有成為抗PRRSV新型疫苗的潛力[20]。鄭其升等構(gòu)建了共表達(dá)PRRSV NJ-a株GP4， GP5和M蛋白的重組病毒rMVA-GP5/M/GP4[21]。利用該重組病毒rMVA-GP5/M/GP4免疫小鼠3周后，便可以檢測出特異性PRRSV中和抗體，8周后檢測發(fā)現(xiàn)中和抗體效價達(dá)到25，并能持續(xù)4周；淋巴細(xì)胞增殖試驗發(fā)現(xiàn)，重組病毒可以使免疫小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞增殖反應(yīng)，該研究說明rMVA-GP5/M/GP4免疫原性較好，可以作為新型PRRS候選疫苗進(jìn)行進(jìn)一步研究。許信剛等成功構(gòu)建了表達(dá)PRRSV GP5蛋白的口服重組減毒鼠傷寒沙門氏菌活載體疫苗株X4550（pYA3341-ORF5）。將重組菌口服免疫小鼠后可以產(chǎn)生抗GP5蛋白的中和抗體，同時，還發(fā)現(xiàn)重組菌株可以調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫；除此之外，淋巴細(xì)胞增殖試驗還發(fā)現(xiàn)，該重組菌能夠誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強的細(xì)胞免疫應(yīng)答[22]。

3.2.2 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗是用基因工程技術(shù)將強毒株毒力相關(guān)基因切除構(gòu)建的活疫苗，該苗安全性好、不易返祖；其免疫接種與強毒感染相似，機體可對病毒的多種抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答；免疫力堅強，免疫期長，尤其適于局部接種，誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫，因而是較理想的疫苗。

武華等通過多年研究獲得了一種PRRSV基因缺失疫苗毒株TJM-F92，該疫苗安全性好，懷孕的母豬、幼齡的仔豬都能用。注射疫苗3 d后，豬就產(chǎn)生抗體，可迅速有效地抵抗“藍(lán)耳病”的自然感染[23]。能使豬“藍(lán)耳病”的保護(hù)率達(dá)到80%以上。

3.3 DNA疫苗

DNA疫苗是應(yīng)用基因工程技術(shù)把編碼保護(hù)性抗原的基因與能在真核細(xì)胞中表達(dá)的載體DNA重組，這種目的基因與表達(dá)載體的重組DNA可直接接種到動物體內(nèi)，目的基因可在動物體內(nèi)表達(dá)，刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。

馬德慧等成功構(gòu)建了基因疫苗表達(dá)載體pEGP5-C1和pEM-C1，并進(jìn)行了小鼠免疫試驗，結(jié)果表明重組基因疫苗質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性中和抗體，并且從二免后的第一周開始檢測到特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[24]。高磊等分別構(gòu)建了單獨表達(dá)PRRSV GP5基因以及PRRSV GP5基因和豬IL-18基因共表達(dá)的重組核酸疫苗質(zhì)粒（pEGFP-GP5和pEGFP-IL 18-GP5 ）[25]。試驗表明，接種pEGFP-IL18-GP5核酸疫苗的仔豬體內(nèi)產(chǎn)生抗體的數(shù)量，產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)和特異性T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均高于接種pEGFP-GP5組。杜東華等構(gòu)造了pcDNA-GP5-M-N真核重組質(zhì)粒，然后用重組質(zhì)粒pcDNA-GP5-M-N免疫Balb/c小鼠，中和抗體檢測結(jié)果表明，首免后2周即有小鼠產(chǎn)生可檢測到的病毒中和抗體（1∶4），隨后抗體水平快速升高，第8周抗體效價達(dá)到最高（1∶32），該試驗結(jié)果表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA-GP5-M-N能誘發(fā)免疫小鼠產(chǎn)生較高水平的中和抗體[26]。

4 展望

目前我國在PRRS的預(yù)防控制上主要采用的還是常規(guī)疫苗，但是由于滅活疫苗免疫效果差、免疫反應(yīng)持續(xù)時間短、需要多次接種、對異源株免疫保護(hù)效果差以及弱毒疫苗存在散毒和毒力返強等缺點，因此加快新型生物技術(shù)疫苗的研究并將其推廣到臨床應(yīng)用已迫在眉睫。

生物技術(shù)疫苗憑借其使用安全、保護(hù)效果好等優(yōu)勢成為當(dāng)前人們研究的熱點，隨著學(xué)者們對豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究的不斷深入，人們對其保護(hù)性抗原基因已經(jīng)基本確定，這些研究成果將為開發(fā)新型PRRS疫苗提供依據(jù)?？蒲泄ぷ髡邆兛梢詫⒖乖蛏吓c免疫反應(yīng)無關(guān)的作用位點剔除或突變，或者同時將幾種不同的保護(hù)性抗原基因整合到同一重組質(zhì)粒，這樣一個重組質(zhì)粒便可以同時表達(dá)多種保護(hù)性抗原，使疫苗的免疫保護(hù)水平大大提升?；蛉笔б呙缗c其他疫苗之間無免疫干擾性，可以和其他疫苗一起使用，并且儲存和使用都比較方便，是很有潛力的新型疫苗，值得進(jìn)行深入研究。除此之外，理想的疫苗佐劑和表達(dá)載體也是接下來需要深入研究的。

總之，伴隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相信會有越來越多的新型PRRS疫苗將被應(yīng)用于臨床實踐。█（編輯：李雨慈）

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[2] 胡恒龍，王強，左瑞華.豬繁殖與呼吸綜合征-豬藍(lán)耳病的診斷與防制[J].畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（7-8）：29-33.

[3] 郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病，1996（2）：1-4.

[4] 王東東，鄧雨修，招麗嬋，等.我國豬繁殖與呼吸綜合征流行概況[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（5）：101-104.

[5] 周建勝.山東省豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及PRRS滅活疫苗免疫技術(shù)研究[D].山東：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[6] 郭寶清，蔡雪暉，劉文興，等.豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的研制[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000，22（4）：259-261.

[7] 王星晨，李郁，王桂軍，等.豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備及免疫試驗[J].中國生物制品學(xué)雜志，2010，23（4）：382-384.

[8] 李麗琴，蔡雪輝，劉永剛，等.PRRSV變異株活疫苗和火活疫苗免疫特性的研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報.2010，32（6）：465-472.

[9] Nilubol D， Platt K B， Halbur P G， et al. The effect of a killed porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） vaccine treatment on virus shedding in previously PRRSV infect-ed pigs [J]. Vet Microbiol， 2004， 102（122）： 11-18.

[10] 王隆柏，魏宏，陳少鶯，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活疫苗安全性和免疫原性測定[J].中國獸醫(yī)雜志，2007，22（2）：185-187.

[11] 胡守萍，張卓，蔡雪輝，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗和變異株滅活疫苗的免疫效果評價[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報.2009，31（5）：392-396.

[12] 劉海珍，張俊文.不同豬藍(lán)耳病疫苗對仔豬免疫效果對比試驗[J].中國畜禽種業(yè)，2013，（2）：42-43.

[13] 冷雪，李真光，夏銘崎，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的研制[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（11）：1171-1175.

[14] 李惠蘭，孫永祥，李樹博，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫試驗報告[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2011（11）：43.

[15] 徐小艷，徐正軍，陳昌海，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）免疫效果及安全性試驗[J].Animal Husbandry&Veterinary Medicine，2014， 46（4）：118-119.

[16] NIELSEN J，BOTNER A，BILLE-HANSEN V，et al.Experimental inoculation of late term pregnant sows with a field isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine-derived virus[J].Vet Microbiol，2002，84（1/2）：1-13.

[17] Jianzhong Hu，Yanyan Ni，Barbara A ，et al.Immunogenicity study of plant-made oral subunit vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）[J].Vaccine，2012（30）：2068-2074.

[18] 錢洪喜.PRRSV N基因原核雙基因表達(dá)載體與畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)研究[D].四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[19] Plana Duran J，Climent I.Sarraseca J，et al.Baculovirus expression of proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain OIot/91.In volvement of ORF3 and ORF5 proteins in protection[J].Virus Genes，1997，14（1）：19-29.

[20] 仇玉，王明珍.豬繁殖與呼吸綜合征病毒三種不同基因活載體疫苗的免疫性研究[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2011，36（1）：28-31.

[21] 鄭其升，畢志香，李鵬，等.共表達(dá)豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒NJ-a株ORF4.ORF5與ORF6基因重組改良型痘苗病毒安卡拉株的構(gòu)建[J].微生物學(xué)報，2007，47（2）：345-349.

[22] 許信剛，趙紅妮，童德文.表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗株的構(gòu)建及動物免疫試驗[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42（7）：955-962.

[23] 王梅.泰州醫(yī)藥城研發(fā)豬"藍(lán)耳病"基因缺失活疫苗[EB/OL].http：//www.jsagri.gov.cn/news/files/536397.asp，2012-07-31/2014-05-01.

[24] 馬德慧，薛江東，劉鍇，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5、M蛋白基因的克隆及其基因疫苗構(gòu)建[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30（2）：150-153.

[25] 高磊，等.PRRSV GP5蛋白與豬IL-18基因共表達(dá)核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究[D].吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[26] 杜冬華，周靜，王愛華，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒HB-3株GP5-M-N蛋白核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2014，34（2）：177-181.