蘇少虎 李冉

摘 要：對(duì)新疆地區(qū)奶牛乳房炎（包括隱性乳房炎和臨床乳房炎）進(jìn)行了發(fā)病率和致病菌進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)7個(gè)牧場(chǎng)隱性乳房炎發(fā)病率在11.3%～28.8%。大部分乳房炎發(fā)病為單一細(xì)菌感染引起。隱性乳房炎中共分離得到9個(gè)不同種屬的病原菌，以凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌為最常見(jiàn)。臨床乳房炎樣品中共分離得到11個(gè)不同種屬的樣品，流行度最高的四種病原菌為凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌。在隱性乳房炎和臨床乳房炎樣品中均分離得到了金黃色葡萄球菌。

關(guān)鍵詞：奶牛乳房炎；病原菌；流行病學(xué)

奶牛乳房炎（bovine mastitis）是乳房受到物理、化學(xué)、微生物等致病因子刺激所發(fā)生的一種紅、熱、腫、痛的炎性變化[1]。乳房炎是奶牛最常發(fā)的疾病之一，同時(shí)也是對(duì)奶牛場(chǎng)危害最大、導(dǎo)致奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一[2]。奶牛乳房炎最主要的病因是病原微生物感染乳腺組織，目前為止已發(fā)現(xiàn)的約150多種致病菌中，常見(jiàn)的有23種，包括球菌、桿菌、支原體、真菌或酵母菌、病毒等[3]。在所有的病原微生物中，細(xì)菌感染是最主要的。奶牛乳房炎分為臨床乳房炎和隱性乳房炎。臨床乳房炎的主要特點(diǎn)是乳汁發(fā)生肉眼可見(jiàn)變化，包括顏色發(fā)生改變，乳汁中有凝塊和絮狀沉淀等；或者乳房局部發(fā)生紅熱腫痛變化；或者奶牛本身發(fā)生了系統(tǒng)性變化包括食欲降低、發(fā)熱、精神萎靡等。隱性乳房炎僅表現(xiàn)出乳汁的體細(xì)胞數(shù)（SCC）升高和細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性等。

實(shí)際上，弄清病原菌的類(lèi)型對(duì)乳房炎的防控和治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。在此基礎(chǔ)上，筆者對(duì)新疆地區(qū)的7 個(gè)地理位置不同的規(guī)?；膛?chǎng)乳房炎發(fā)病情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，旨在揭示引起新疆地區(qū)奶牛臨床乳房炎和隱性乳房炎發(fā)病的主要病原菌分布情況，以期為牧場(chǎng)乳房炎防控與治療提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

CMT診斷液由北京奶牛中心提供；各種細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基及選擇性鑒定培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋試劑司；生化編碼鑒定管GYZ-15e、TH-16S、鏈球菌屬生化編碼鑒定系統(tǒng)和鑒定相關(guān)配套試劑購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR 反應(yīng)聚合酶、DNA 分子Marker、瓊脂糖、PCR 膠回收試劑盒，均購(gòu)自北京全式金生物公司。

1.2 采樣牛場(chǎng)

選擇新疆地區(qū)7個(gè)規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，每個(gè)奶牛場(chǎng)隨機(jī)無(wú)菌收集乳區(qū)奶樣份80份，共560份冰盒中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。根據(jù)牛場(chǎng)的發(fā)病情況，在抗生素治療前無(wú)菌收集臨床乳房炎樣品共81份，放在牛場(chǎng)冰箱中冷凍或冷藏，統(tǒng)一運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

1.3 乳樣的采集及隱性乳房炎的檢測(cè)

清洗乳房后用紙巾擦干，棄掉前3把奶，用0.5%碘伏溶液進(jìn)行乳頭藥浴30 s，再用無(wú)菌棉球?qū)⑷轭^孔擦干并用75%酒精反復(fù)擦拭乳頭孔，風(fēng)干后接取10～15 mL乳樣于無(wú)菌乳樣瓶中，整個(gè)采樣過(guò)程中嚴(yán)禁污染。返回實(shí)驗(yàn)室后于每管中取2 mL乳樣置于診斷托盤(pán)上，在每個(gè)托盤(pán)中加入2 mL CMT隱性乳房炎診斷液，搖勻，30 s后觀察結(jié)果。隱性乳房炎根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象和CMT隱性乳房炎診斷液判定標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1）進(jìn)行判斷，陽(yáng)性以上（SCC>50萬(wàn)/mL）判定為隱性乳房炎樣品。

1.4 乳房炎病原菌的分離和純化

吸取100 μL乳房炎奶汁，用接種環(huán)劃線接種于5%羊血TSA 培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)24 h。在平板上判斷是否存在污染，如未污染，挑取單菌落再次劃線接種于5%羊血TSA培養(yǎng)基上，進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察菌落大小、顏色、形狀及溶血狀況等。挑取純化培養(yǎng)的細(xì)菌單菌落進(jìn)行革蘭染色，分為陽(yáng)性桿菌、陰性桿菌、陽(yáng)性球菌和陰性球菌。陽(yáng)性球菌進(jìn)行觸酶試驗(yàn)，陽(yáng)性者進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)并接種至7.5%氯化鈉甘露醇培養(yǎng)基。陰性桿菌接種于麥康凱培養(yǎng)基和SS培養(yǎng)基上，陽(yáng)性桿菌和陰性球菌視情況進(jìn)行細(xì)菌的測(cè)序鑒定。

1.5 乳房炎病原菌的鑒定

1.5.1 生化鑒定

觸酶陽(yáng)性且在7.5%氯化鈉甘露醇培養(yǎng)基生長(zhǎng)的細(xì)菌用葡萄球菌編碼系統(tǒng)鑒定；將觸酶試驗(yàn)陰性的細(xì)菌接種至鏈球菌生化編碼鑒定系統(tǒng)。取在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并變色的革蘭陰性桿菌接種至腸桿菌科生化編碼鑒定系統(tǒng)，培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果，根據(jù)各種鑒定管的顏色變化進(jìn)行編碼鑒定。

1.5.2 16S rRNA基因測(cè)序鑒定

對(duì)于生長(zhǎng)性狀較復(fù)雜和革蘭染色結(jié)果較特殊、不能通過(guò)生化鑒定方法鑒別的菌株進(jìn)行測(cè)序鑒定。具體操作方法如下：將單個(gè)菌株接種于增菌肉湯中，37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)； 離心，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，用Premier軟件設(shè)計(jì)16Sr RNA基因的通用引物rDNA-1（5'-GAGATTGATCTGGACCAG-3'）和rDNA-2（5'- TAGCTGGTTACGACAT-3'），經(jīng)過(guò)Blast比對(duì)，確定其通用性。設(shè)定并摸索合適的PCR反應(yīng)體系以得到清晰的單一條帶用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，如果在1 500 bp 處有清晰條帶，且無(wú)特異性條帶，可以進(jìn)行PCR 產(chǎn)物的純化測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)細(xì)菌種屬進(jìn)行精確判定。

2 結(jié)果

2.1 隱性乳房炎發(fā)病率

由表2看出，新疆地區(qū)牛場(chǎng)中隱性乳房炎的發(fā)病率在11.3%～28.8%之間，各牛場(chǎng)的隱性乳房炎發(fā)病率差異明顯，平均發(fā)病率為21.4%。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)情況

120份隱性乳房炎樣品接種到平板上，有102份呈現(xiàn)陽(yáng)性生長(zhǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為85%。其中有91份樣品為單一細(xì)菌生長(zhǎng)，8份樣品有兩種細(xì)菌生長(zhǎng)；3份樣品有三種及以上細(xì)菌生長(zhǎng)，污染率為3%。81份臨床乳房炎樣品中，有65份呈現(xiàn)陽(yáng)性生長(zhǎng)，細(xì)菌陽(yáng)性培養(yǎng)率為80%；其中53份樣品為單一細(xì)菌生長(zhǎng)，6份樣品為兩種細(xì)菌生長(zhǎng)；6份樣品為三種及以上細(xì)菌生長(zhǎng)，污染率為7%。

2.3 細(xì)菌測(cè)序鑒定結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，不同種屬的病原菌均可通過(guò)16S rRNA基因的序列測(cè)定，擴(kuò)增出約1 600 bp的片段。

2.4 乳房炎病原菌種類(lèi)

經(jīng)過(guò)生化鑒定和測(cè)序鑒定相結(jié)合的方法，共分離鑒定得到隱性乳房炎病原菌107株，分為9個(gè)不同種屬（圖2），其中最多的三種隱性乳房炎病原菌依次為凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌。臨床乳房炎病原菌65株，分為11個(gè)不同種屬（圖3），其中最多的四種病原菌依次為凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌。

3 討論

3.1 乳房炎發(fā)病率

試驗(yàn)結(jié)果表明，新疆地區(qū)的隱性乳房炎發(fā)病率為21.4%，各牛場(chǎng)之間的發(fā)病率存在較大的差異，這是由于衛(wèi)生狀況和管理措施存在差異造成的。單志貴、蕭乾慶、楊章平和雙金等報(bào)道的隱性乳房炎乳區(qū)發(fā)病率分別為59.1%、31.9%、28.0%和32.28%[3-6]，均高于本調(diào)查顯示的結(jié)果，說(shuō)明可能隨著環(huán)境衛(wèi)生、擠奶操作的提升，在我國(guó)隱性乳房炎的發(fā)病率存在著一定程度的降低。實(shí)際上，正確的擠奶操作流程，良好的擠奶設(shè)備維護(hù)和優(yōu)質(zhì)的臥床墊料管理，對(duì)降低乳房炎的發(fā)病率至關(guān)重要。乳房炎的樣品中大部分細(xì)菌培養(yǎng)為陽(yáng)性，但是也有少部分未培養(yǎng)出細(xì)菌，分析原因有以下幾點(diǎn)：引起乳房炎的病原微生物不能通過(guò)普通培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)，比如支原體和部分真菌；細(xì)菌量太低導(dǎo)致使用普通微生物培養(yǎng)法難以保證高靈敏度；部分由金葡菌感染的病例，細(xì)菌可能進(jìn)入到中性粒細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致無(wú)法檢測(cè)出；臨床乳房炎是由革蘭氏陰性桿菌引起，病例發(fā)現(xiàn)較晚，在檢測(cè)時(shí)細(xì)菌已經(jīng)被乳房?jī)?nèi)的炎癥細(xì)胞殺滅。因此，盡管病原微生物培養(yǎng)有時(shí)為陰性，但這類(lèi)乳房炎病例仍然不能被忽視。同時(shí)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分乳房炎樣品中分離得到了單一類(lèi)型的病原菌，說(shuō)明無(wú)論是隱性乳房炎還是臨床乳房炎，其發(fā)病主要是由單一種屬細(xì)菌感染引起的，同時(shí)也說(shuō)明本試驗(yàn)的無(wú)菌采樣工作較好，出現(xiàn)乳樣污染的情況較少。

3.2 乳房炎病原菌流行情況

通過(guò)本次流行病學(xué)調(diào)查可知，在新疆地區(qū)引起隱性乳房炎最主要的致病菌為凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌；引起臨床乳房炎的病原菌主要為凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院中獸醫(yī)研究所在上世紀(jì)80年代對(duì)西北、華北、東北、華南地區(qū)22個(gè)城市32個(gè)奶牛場(chǎng)的一萬(wàn)余頭成年泌乳牛進(jìn)行了臨床型乳房炎病因及發(fā)病情況調(diào)查[7]，我們的最主要病原菌分離結(jié)果與其具有一定的差異，說(shuō)明我國(guó)乳房炎的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化。

3.3 主要病原菌流行原因分析

凝固酶陰性葡萄球菌是一種條件致病菌，盡管在我國(guó)的乳房炎防治中還未引起相應(yīng)的關(guān)注，但外國(guó)乳房炎研究者對(duì)其引起的乳房炎進(jìn)行了細(xì)致、系統(tǒng)的報(bào)道[8-10]，并表明由這類(lèi)病原菌引起的乳房炎發(fā)病正處于上升趨勢(shì)；我們的調(diào)查結(jié)果呼應(yīng)了這方面報(bào)道：應(yīng)該對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌性乳房炎進(jìn)行詳細(xì)地研究，并在臨床防治上給予高度的重視。無(wú)乳鏈球菌主要寄存于患病的乳腺組織中，通過(guò)不規(guī)范的擠奶操作和管理不當(dāng)在牛群中進(jìn)行傳播。引起的乳房炎具有高傳染性。在本部分研究中，無(wú)乳鏈球菌引起乳房炎的比例也較高，提醒我們目前在國(guó)內(nèi)的牛場(chǎng)中，廣泛存在著擠奶操作不規(guī)范、管理混亂等問(wèn)題，這些都是需要研究者結(jié)合臨床獸醫(yī)及管理者，共同面對(duì)、解決的。大腸桿菌作為一種環(huán)境性致病菌，與牛場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生關(guān)系最大，同時(shí)大腸桿菌性乳房炎可能因?yàn)槠鋬?nèi)毒素的釋放引起全身性的敗血癥，應(yīng)該引起臨床獸醫(yī)的重視，在治療時(shí)采用非甾體抗炎藥結(jié)合抗生素的治療方式，可提高治療效果?！觯ň庉嫞旱一郏?/p>

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