魏曉愛等

摘要[目的]明確菌株Ha1降解阿特拉津（AT）的最適環(huán)境因素。[方法]采用液相色譜法測定降解體系中阿特拉津的殘留量。[結(jié)果]K+和Mg2+對菌株Ha1降解阿特拉津有促進作用，Cu2+、Cd2+等離子則抑制其降解功能的發(fā)揮；溶液的緩沖性、pH、溫度、供氧方式、反應(yīng)體系、菌株的濃度和氰尿酸（CA）對菌株 Ha1降解阿特拉津有影響。[結(jié)論]該研究結(jié)果為生物修復(fù)被阿特拉津污染的水環(huán)境奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞阿特拉津；Arthrobacteria sp.Ha1；降解速率

中圖分類號S451.2文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2014）36-13062-04

Abstract[Objective] It was cleared that the optimum environmental factors of strain Arthrobacter sp.Ha1 biodegradating atrazine.[Method] The atrazine residue in the system was determined with liquid chromatography.[Result] Atrazine biodegradation was significantly promoted by the addition of K+ or Mg2+and significantly restrained by the addition of positive ion such as Cu2+ and Cd2+.The atrazine degraded by strains Ha1 was affected by metal ion， pH， temperature， oxygen， cell concentrations and cyanuric acid.[Conclusion] The results laid the theoretical foundation for bioremediation of atrazine contamination in the water environment.

Key wordsAtrazine； Arthrobacter sp.Ha1；Degradation rate

阿特拉津（C8H14ClN5，Atrazine，簡稱AT），又名莠去津，化學(xué)名稱為2氯4乙胺基6異丙胺基1，3，5三嗪，是一種半衰期長的三嗪類除草劑[1]。因其可移動性強，在河流、地下水、地表水中常?？梢詸z測出阿特拉津的存在[2]。每年有2百萬～3百萬人在飲用被阿特拉津污染的水[3]。歐洲委員會在有關(guān)飲用水的規(guī)定中明確指出[4]：任何農(nóng)藥在飲用水中的含量不可超過0.1 μg/L。1998年我國規(guī)定Ⅰ、Ⅱ類地表水中阿特拉津的標準為3.0 μg/L[5-7]，而實際上我國淮河的4個監(jiān)測點的阿特拉津含量都在81.3 μg/L 以上[8]。因阿特拉津?qū)θ诵笪：Υ螅钥刂坪椭卫戆⑻乩虻奈廴臼鞘澜绺鲊诖鉀Q的問題?？梢酝ㄟ^化學(xué)方法修復(fù)阿特拉津的污染，而生物降解的方法因?qū)Νh(huán)境的二次污染小而受到人們的廣泛關(guān)注[9-10]。為此，筆者研究了從土壤中獲得的阿特拉津高效降解菌Arthrobacter sp.Ha1在低營養(yǎng)條件下的降解特性及與環(huán)境因素的關(guān)系，旨在為利用Ha1菌株修復(fù)被阿特拉津污染的水體提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.Ha1（簡稱Ha1），由東北林業(yè)大學(xué)森林病蟲害生物學(xué)國家林業(yè)局重點實驗室分離及鑒定。

1.1.2試劑與藥劑。阿特拉津原藥由遼寧省營口市三征農(nóng)藥廠惠贈；除氰尿酸和阿特拉津標準樣品購自西格瑪公司外，其他試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基 （LB）：1 L去離子水中含NaCl 10.0 g、酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨 10.0 g。微量元素：MnSO·H2O 1.00 g、FeSO4·7H2O 1.00 g、H3BO4 0.10 g、NaMoO4·2H2O 0.25 g、ZnCl2 0.25 g、CuCl2·2H2O 0.25 g、Co（NO3）2·6H2O 0.25 g、NH4NO3 0.10 g、NiSO4·6H2O 0.10 g、濃H2SO4 5 ml，定容至1 000 ml?；A(chǔ)鹽培養(yǎng)基（BSM）：KH2PO4 0.45 g、MgSO4·7H2O 0.20 g、NaCl 0.40 g、K2HPO4 179 g、微量元素1 ml、pH7.5，定容至1 000 ml。

1.1.4儀器。Ultrospec 4200 pro型分光光度計；ER52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Waters 2695型液相色譜儀。

1.2方法

1.2.1殘留阿特拉津的檢測。

萃取反應(yīng)體系中的阿特拉津（培養(yǎng)液與三氯甲烷的比例為10∶1，V/V），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干提取液，色譜甲醇溶解稀釋殘留物后用HPLC檢測。檢測條件：Waters 2996紫外檢測波長為216 nm；柱溫25 ℃；流動相為水-甲醇（20∶80，V/V）；進樣量5 μl ；流速為1 ml/min； 250 mm×416 mm C18不銹鋼色譜柱。阿特拉津保留時間為1.68 min。以已知濃度的阿特拉津標準樣品的吸收值做標準曲線，求待測阿特拉津的濃度。

1.2.2菌液的制備及Ha1對阿特拉津的降解條件。

1.2.2.1菌液的制備。LB培養(yǎng)基中接種菌株Ha1，150 r/min、30 ℃下?lián)u培48 h，5 000 r/min離心10 min，用滅菌的生理鹽水洗滌2次，懸浮于磷酸鉀緩沖液（50 mmol/L，pH70）中，保存于4 ℃冰箱，備用。

1.2.2.2Hal對阿特拉津的降解條件。阿特拉津降解體系： 0.5 g/L阿特拉津的MgCl2溶液，接種濃度1.0×107個/ml，150 r/min、28 ℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，設(shè)不加菌液的處理為空白對照，每4～6 h檢測其降解情況（如無特殊說明，試驗皆采用該反應(yīng)體系）。環(huán)境條件對阿特拉津降解速率的影響：①金屬離子。以0.5 g/L阿特拉津的去離子水為降解體系，加入Mg2+、Fe2+等14種不同的金屬離子，加入菌液使終濃度為1.0×107個/ml。②pH的影響。配制不同pH的50 mmol/L磷酸緩沖液和非緩沖液（NaOHHCl溶液）（pH為6.0到110），加菌液和阿特拉津。③反應(yīng)體系的影響。用含0.5 g/L阿特拉津 MgCl2和BSM 2種體系，加入菌液使終濃度為1×106、1×107、1×108 個/ml，定期檢測Ha1降解情況。④初始Ha1菌液濃度的影響。在MgCl2溶液中分別加入菌液，使終濃度為0、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個/ml，定期測定阿特拉津的含量。⑤氧氣的影響。設(shè)置搖床振蕩（150 r/min）、靜置、充氮靜置和充氧靜置4種供氧培養(yǎng)方式，分別加入菌液使終濃度為1.0×107個/ml，5 d后測定降解率。⑥溫度的影響。在含0.5 g/L阿特拉津的MgCl2和BSM液體中加入菌液，使終濃度為1.0×107個/ml，分別置于4、20、25、30、37、45 ℃搖床中搖培，72 h后測定阿特拉津的降解率。⑦氰尿酸的影響。MgCl2溶液中含有1 g/L阿特拉津、氰尿酸和阿特拉津+氰尿酸的混合液，定期檢測阿特拉津的含量。

2結(jié)果與分析

2.1金屬離子對降解的影響

許多金屬離子作為輔基、促進因子、抑制因子等參與酶的催化活動[11]，微生物降解有機污染物的能力與金屬離子密切相關(guān)[12-13]。由表1可知，在降解過程中，菌體自身或者由菌體產(chǎn)生的阿特拉津降解酶可能對某些金屬離子格外“敏感”， Cu2+、 Cd2+、Co2+等離子對菌株Ha1降解阿特拉津有抑制作用。其中Cu2+離子的抑制作用最明顯，在0.1 μmol/L時，降解速率僅為1.940 mg/（L·h），而對照為3.780 mg/（L·h）。K+、Mg2+等離子對菌株Ha1降解阿特拉津具有明顯的促進作用，其中Mg2+離子促進作用最顯著，1.0 mmol/L濃度時降解速率達11.310 mg/（L·h），是對照的3倍。對比分析K+、Mg2+離子在0.1、1.0、10.0 mmol/L時Ha1降解阿特拉津的效果，1 000.0 μmol/L是促進菌株Ha1降解阿特拉津的最佳濃度。

2.2pH和溫度對降解的影響

以非緩沖液及磷酸鹽緩沖液為反應(yīng)體系，測定了pH與降解速率的關(guān)系及緩沖體系對降解的影響（圖1）。在非緩沖液和磷酸鹽緩沖液2種溶液中菌株Ha1對阿特拉津的降解速率均表現(xiàn)出隨著pH的增加而先增加后減小的趨勢，分別在pH7.5和7.0時達到最大值，但在緩沖溶液中的最大降解速率僅為1.380 mg/（L·h），而在非緩沖溶液中的最大降解速率為6.30 mg/（L·h），兩者相差3.44倍，表明緩沖溶液對菌株Ha1降解阿特拉津具有一定的抑制作用。余冰賓報道[14]磷酸鹽緩沖液會抑制某些生物化學(xué)過程，如對某些酶的催化作用會產(chǎn)生某種程度的抑制。該研究的結(jié)論與其一致。在磷酸鹽緩沖溶液中菌株Ha1的最適降解pH為8.0，而在非緩沖溶液中的最適降解pH為9.0。溫度對菌株Ha1的降解率具有顯著影響。菌株Ha1在BSM反應(yīng)體系中，最適降解溫度范圍為25～37 ℃，72 h的降解率可達到99.55%；而在MgCl2反應(yīng)體系中最適降解溫度為25 ℃，72 h的降解率為72.73%。37 ℃時，MgCl2反應(yīng)體系抑制菌株Ha1對阿特拉津的降解，但BSM反應(yīng)體系中由于營養(yǎng)成分利于細胞的生長繁殖，新生細胞產(chǎn)生的大量水解酶彌補了高溫抑制菌體降解能力的下降，使其降解率仍達99.92%（圖2）。

2.3反應(yīng)體系及Ha1菌液濃度對降解的影響

為探索反應(yīng)體系對降解的影響，分別在BSM培養(yǎng)液和MgCl2溶液中加入1×106、1×107、1×108 個/ml 3種濃度的菌懸液，結(jié)果表明，BSM降解體系在相同條件下優(yōu)于MgCl2體系。MgCl2溶液中96 h的Ha1降解率為20%～100%，且Ha1菌體數(shù)量基本未增加；而BSM培養(yǎng)液中3種濃度的阿特拉津降解率均達100%僅需72 h，且隨著菌液濃度的增大降解時間縮短（圖3）。

一般來說，微生物對有機污染物的降解效果與自身的密度和活性有關(guān)[13]。Ha1在細胞滅活和6種濃度下對阿特拉津的降解表明，Ha1菌體在0～5×108 個/ml濃度范圍內(nèi)，對阿特拉津的降解速率隨濃度的升高而加快，濃度為5×108個/ml時降解1 g/L的阿特拉津僅需要36 h，表明Ha1對阿特拉津具有很強的降解能力，而滅活細胞幾乎沒有降解能力（圖4）。進一步研究表明，當(dāng)細胞濃度大于5×108個/ml時，隨細胞濃度的增加降解速率并不增加。

2.4氧氣及氰尿酸對降解率的影響

為探索氧氣與Ha1降解率的關(guān)系，測定了不同供氧條件下的Ha1降解率。由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)體系中充滿氮氣時，由于缺乏氧氣阿特拉津幾乎未被降解，說明Ha1對阿特拉津的降解過程需要氧氣的參與。Ha1靜息細胞在加氧靜止和空氣供氧條件下對阿特拉津的降解率無顯著差異，表明自然供氧完全能夠保障Ha1降解力的發(fā)揮。在搖床自然供氧過程中，可能由于培養(yǎng)液的搖動增加了酶與底物的接觸機率，使Ha1對阿特拉津的降解達到較高的水平。氰尿酸是阿特拉津降解過程中的中間產(chǎn)物[11]，在降解過程中氰尿酸的累積必然會影響菌株Ha1對阿特拉津的降解。結(jié)果表明，菌株Ha1既可以降解阿特拉津，也可以降解氰尿酸，降解氰尿酸的速度快于阿特拉津，同樣是1 g/L，降解氰尿酸僅為36 h，而降解阿特拉津則需要72 h。菌株Ha1在外源氰尿酸存在的條件下，降解1 g/L的阿特拉津需84 h，表明外源氰尿酸抑制了阿特拉津的降解（圖6）。

3討論

生物對阿特拉津降解的實質(zhì)是其合成酶對阿特拉津的降解，酶作為生物產(chǎn)生的催化劑能催化各種生物化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)速度不僅受到酶和底物濃度的影響，同時也和溫度、pH、激活劑和抑制劑有關(guān)。蔡寶立等報道在阿特拉津降解過程中有3種關(guān)鍵酶：①阿特拉津水解酶（簡稱AtzA），該酶催化阿特拉津水解脫氯反應(yīng)產(chǎn)生羥基阿特拉津，是一種功能性的金屬酶[11]；②羥基阿特拉津乙胺基水解酶（簡稱AtzB），具有催化羥基阿特拉津脫酰胺基反應(yīng)而產(chǎn)生N異丙基氰尿酰胺；③N異丙基氰尿酰胺異丙基水解酶（簡稱AtzC），是一種具有轉(zhuǎn)化N異丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和異丙胺功能的酶。該研究對金屬離子的測定結(jié)果表明，K+和Mg2+對Ha1降解阿特拉津具有促進作用，而Cu2+、Cd2+等具有抑制降解的作用，據(jù)此推測AtzA在Mg2+和K+的存在下其活性得到提高，但Cu2+、Cd2+等離子對Ha1降解阿特拉津的抑制機制尚不清楚，具體影響哪種酶的活性有待于進一步研究。另外，在未加任何金屬離子的情況下，對照降解速率仍可達3.780 mg/（L·h），其結(jié)果與AtzA的特點看似不符。但由于Ha1懸浮于磷酸鉀緩沖溶液中，K+離子的存在可能使降解酶活性得以充分發(fā)揮。Ha1對阿特拉津的降解需要氧的參與，在厭氧的條件下，酶的活性幾乎完全受到抑制，這一點符合單加氧酶的特性。

胡江等[15]報道阿特拉津降解菌Exiguobacterium sp.在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的最適降解溫度范圍為25～30 ℃；代先祝等[15]報道了Pseudomonas sp.在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的最適降解溫度區(qū)間在37～42 ℃，該研究中所使用的降解菌Arthrobacter sp.Ha1無論是在BSM中還是在營養(yǎng)貧瘠的MgCl2體系中，20～45 ℃都具有良好的降解效果。在營養(yǎng)貧瘠的MgCl2體系中45 ℃、72 h的降解率仍可達到40%，表明該菌株在修復(fù)營養(yǎng)貧瘠的地下水污染方面將具有良好的應(yīng)用前景。

Strong等[17]把來自假單胞菌ADP菌株的atzA基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，構(gòu)建了工程菌株后用滅活細胞進行了土壤修復(fù)，56 d內(nèi)土壤中阿特拉津降解率為52%。胡江等[18]利用微小桿菌屬（Exiguobacterium sp，BTAH1）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp，AG）降解菌生長細胞修復(fù)被阿特拉津污染的土壤，8 d后土壤中阿特拉津的降解率分別達96.9%和96.4%。該研究中Arthrobacter sp.Ha1在細胞濃度達到1×108個/ml 時僅48 h BSM體系中的阿特拉津降解率就可達100%， 而營養(yǎng)貧瘠的MgCl2溶液中降解0.5 g/L的阿特拉津也只需84 h，說明該菌株具有更強的降解能力。

在該試驗選擇的細胞濃度和MgCl2溶液降解體系未觀察到生物量增加，細胞基本上處于靜息狀態(tài)。菌株Ha1靜息細胞能降解阿特拉津和氰尿酸的混合物，但氰尿酸在一定程度上抑制Ha1對阿特拉津的降解。氰尿酸作為阿特拉津降解的中間產(chǎn)物，氰尿酸的降解是由AtzD酶來完成的[11]。Ha1靜息細胞成功降解阿特拉津為固定化細胞大規(guī)模降解阿特拉津奠定了基礎(chǔ)。

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