孫靜等

摘要 [目的] 了解寧夏銀川賀蘭山部分區(qū)域巖羊布魯氏菌病的分布情況。[方法] 以提取53份巖羊樣品DNA為模板，使用P1和P2引物進行PCR擴增，對賀蘭山野生巖羊布魯氏菌病的分布狀況進行檢測。[結(jié)果] 53份野生巖羊樣品中布魯氏菌病的陽性檢出率為0。[結(jié)論] 該研究表明寧夏賀蘭山野生巖羊中不存在布魯氏菌病，但還需要進一步研究。

關(guān)鍵詞巖羊；布魯氏菌病；分子生物學；檢測

中圖分類號S826.8+9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12935-02

Abstract[Objective] The research aimed to understand the distribution situations of brucellosis in blue sheep in some regions of Helan Mountains in Yinchuan of Ningxia. [Method] 53 DNA samples extracted from blue sheep were taken as template to make PCR amplification with P1 and P2 primers. The distribution situations of brucellosis in blue sheep in Helan Mountains were detected. [Result] The positive rate of brucellosis in 53 samples of blue sheep was zero. [Conclusion] The research results showed that no brucellosis was detected in these blue sheep， but it needed to be further studied.

Key wordsBlue sheep； Brucellosis； Molecular biology； Detection and analysis

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌屬（Brucella）的細菌侵入機體引起的傳染-變態(tài)反應性的人畜共患的自然疫源性傳染病[1-2]，以流產(chǎn)、早產(chǎn)、不孕、不育、胎盤滯留、睪丸炎、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)損傷為主要臨床癥狀，可造成人體許多器官損傷，甚至終身喪失勞動力或殘疾，迄今為止尚無根治方法[3]。1985年世界衛(wèi)生組織（WHO）布魯氏菌病專家委員會將布魯氏菌病屬分為6個種19個生物型[4]，該病在世界各國均有流行，其中以亞洲、南美洲和非洲等地區(qū)最為嚴重。在我國，該病自1905年在重慶被首次報道[5]，至今已有100多年的歷史了，近年來該病的發(fā)病率逐年快速上升，疫情呈回升趨勢，甚至出現(xiàn)局部爆發(fā)[6]。該病不僅危害畜牧生產(chǎn)，而且嚴重損害人類健康，從而造成巨大的經(jīng)濟損失和嚴重的公共衛(wèi)生問題，因此受到廣泛重視，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，同時被《中華人民共和國傳染病防治法》列為乙類傳染病，同時被《中華人民共和國動物防疫法》列為二類動物疫病[7]。

布魯氏菌病的診斷和檢疫主要依靠血清學檢測和細菌學檢測，但是由于上述2種檢測方法耗時長、影響因素多、檢出率低，不利于該病的早期診斷，且存在假陽性反應，因此在此次調(diào)查中采用PCR方法鑒定樣品是否被布魯氏菌感染。

1材料與方法

1.1待檢樣品寧夏賀蘭山自然保護區(qū)的53份野生巖羊組織樣品。

1.2主要試劑生理鹽水、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、飽和酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、75%乙醇、蛋白酶K、RNase酶、布魯氏菌病活疫苗（S2株）。

1.3方法

1.3.1引物。

通過查閱相關(guān)文獻[8]，選取以下引物：

上游引物P1：5ATG TCT GGC ACA TCA TGG GC3；

下游引物P2：5TCA TGG AGC GGG CCT TGA GAT 3。

引物由上海英俊公司合成。

1.3.2樣品DNA的提取。

①組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取約0.5 g組織，放入1.5 ml離心管中，剪碎；

②加入0.45 ml TES混勻，再加入50 μl SDS（10%）和5.0 μl蛋白酶K（20 mg/ml），充分混勻后，于56 ℃保溫4～6 h，每隔2 h搖動1次；

③放置到室溫下，加入等體積飽和酚（500 μl），顛倒混勻，12 000 r/min，離心10 min，小心吸取上清液，置于1個新的15 ml離心管；

④加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），顛倒混勻，12 000 r/min，離心10 min后，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中；

⑤加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），顛倒混勻，12 000 r/min，離心10 min，取上清液到1個新的15 ml離心管；

⑥加入2.5倍體積的-20 ℃預冷的無水乙醇沉淀DNA；

⑦12 000 r/min，離心10 min，棄掉所有液相；

⑧-20 ℃下保存的75%乙醇洗滌，12 000 r/min，離心5 min，棄去乙醇，干燥DNA；

⑨加入10 μl滅菌去離子水溶解DNA，于-20 ℃下保存，作為模板備用。

1.3.3PCR。

1.3.3.1PCR反應體系。

PCR反應體系由10×PCR Buffer（含Mg2+）5 μl、2.5 mmol/L dNTP 4 μl、上下游引物（20 mmol//L）各1 μl、Taq酶（5 U/μl）0.5 μl、模板DNA 3 μl、去離子水35.5 μl組成。

1.3.3.2PCR反應程序。

95 ℃ 10 min（預變性）；94 ℃ 30 s（變性），55 ℃ 30 s（退火），72 ℃ 1 min（延伸），30個循環(huán)；

72 ℃10 min（延伸）；4 ℃下保存。

1.3.4瓊脂糖凝膠電泳。配制1%的瓊脂糖凝膠，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結(jié)果。

2結(jié)果與分析

提取組織樣品DNA為模板，使用P1和P2引物進行PCR擴增，陽性對照樣品出現(xiàn)預期中的1 276 bp大小的PCR產(chǎn)物，待檢樣品未出現(xiàn)該產(chǎn)物（圖1～3）。

3討論與結(jié)論

3.1PCR方法檢測的優(yōu)勢

經(jīng)典的生化鑒定方法是一項較為繁瑣的工作，且需要進行大量的活菌操作，由于實驗室條件有限，因此筆者采用PCR方法鑒定。該方法具有準確、快速、特異的特點，且不需活菌操作，大大降低了實驗室人員感染布病的風險，因而將PCR等分子生物學技術(shù)引進到菌種的鑒定，可以進一步提高工作的效率和質(zhì)量。但是，樣品的基因組DNA提取困難及試驗過程中的污染等問題會造成PCR檢測結(jié)果的不穩(wěn)定，因此樣品中基因組DNA提取是保障PCR檢測重復性與檢測準確度的重要前提，試驗操作中需要特別注意。

3.2巖羊與布魯氏菌病

巖羊是我國的國家二級重點保護野生動物[9]，同時也被世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）收錄為需予關(guān)注（Least concern）[10]，在我國的生物多樣性中占據(jù)著重要地位。同時，布魯氏菌病的易感動物范圍很廣，目前已知的感染動物包括60多種，其宿主主要包括馴養(yǎng)動物、野生動物、人，其中以羊、牛、豬為主，巖羊極有可能感染該病菌并患病，進而影響到賀蘭山地區(qū)甚至更大范圍內(nèi)的物種多樣性。目前，對國內(nèi)巖羊中布魯氏菌病的相關(guān)檢測數(shù)據(jù)較少，所以對巖羊中布魯氏菌病的分布情況有必要進行檢測和調(diào)查，從而確定是否有必要進行預防。盡管在此次檢測中，巖羊中布魯氏菌病的陽性率為0，但不能說明賀蘭山巖羊不攜帶該病原，因為采集樣品的時間、對象、條件、質(zhì)量、保存等以及試驗環(huán)境的局限性、具體試驗操作中某些人為誤差等等因素都有可能造成檢出率的降低，因此有必要對巖羊中布魯氏菌病的分布狀況進行持續(xù)調(diào)查，以獲得試驗數(shù)據(jù)作為是否進行防治的依據(jù)。

該試驗中53份寧夏賀蘭山野生巖羊中布魯氏菌病陽性檢出率為0。

參考文獻

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[10] HARRIS R B.Pseudois Nayaur[M]//IUCN 2012.IUCN Red List of Threatened Species.Version，2012.