王彩云 李富生 李濤 李彩霞 張曉東 王元忠

摘要：HMA蛋白（heavy metal transporting ATPase）是一種在植物中廣泛存在的多功能蛋白。根據(jù)滇龍膽轉(zhuǎn)錄組GrHMA基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增GrHMA基因序列，并進(jìn)行TA克隆、測(cè)序及序列分析；構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-GrHMA，轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta（DE3）中，并在37℃、1.Ommol/L IPTG下成功誘導(dǎo)表達(dá)。序列分析表明，GrHMA基因是HMA超家族的成員；GrHMA氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CrHMA與TcHMA處于同一進(jìn)化枝。SDS-PAGE結(jié)果表明所表達(dá)蛋白與預(yù)期蛋白大小一致。這些結(jié)果為GrHMA蛋白的進(jìn)一步純化及結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：滇龍膽；GrHMA基因；克??；原核表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）03-0211-07

滇龍膽（Gentiana rigescens）為龍膽科（Gen-tianaceae）龍膽屬多年生宿根草本植物，是我國(guó)特有物種，主要分布于云南、貴州、四川、廣西等省，其中云南是主要產(chǎn)區(qū)。野外主要生長(zhǎng)在海拔1100～3000m雜木林下、荒坡地、山谷灌木叢旁[1]。滇龍膽在云南有悠久的藥用歷史[2]，被《中國(guó)藥典》2010年版收錄，為傳統(tǒng)中藥材龍膽的植物主要來(lái)源之一[3]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)滇龍膽的研究主要集中在栽培、農(nóng)藝性狀、化學(xué)成分研究、礦質(zhì)元素測(cè)定等方面[4-6]，而對(duì)滇龍膽的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其逆境脅迫和抗性研究未見(jiàn)報(bào)道。

重金屬ATP酶（heavy metal transporting AT-Pase，HMA），又稱為P1B-ATPase，其能選擇性地運(yùn)輸Cu+、Cu2+、Zn2+和CO2+等必須的金屬離子，還能轉(zhuǎn)運(yùn)Cu2+、Cd22+和Pb2+等重金屬離子[7]；因其含有一個(gè)保守的內(nèi)膜基序（CPx：Cys-Pro-Cys/His/Ser），又稱為CPx-ATPase[8，9]。植物HMA除參與重金屬離子的穩(wěn)態(tài)外，還涉及植物對(duì)重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒和富集等方面[10，ll]。HMA基因在植物中廣泛存在，如在低等植物綠藻（Chlamydomonas rein-hardtii）中克隆到3個(gè)基因（CrHMA1～3），紅藻（Cyanidioschizon merolae）中克隆到2個(gè)基因（CmHMA1，CmHMA2）。單子葉植物水稻（Oryzasativa）基因組中發(fā)現(xiàn)9個(gè)HMA基因（OsHMAl～9），大麥（Hordei vulgaris）中有10個(gè)HMA基因（HvHMAl-HvHMA10）[11～13]。于擬南芥（Arabidop-sis thaliana）中克隆到8個(gè)HMA基因（AtHMA l～8） [12，14]，大豆（Glycine max）基因組中發(fā)現(xiàn)9個(gè)HMA基因（GmHMAl～GmHMA9）[15]。此外，Southron、Pa-poyan等16，17]從甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）克隆到了P1B-ATPase基因BnRANl（HMA7）；Courbot等[18]從重金屬Zn/Cd超富集植物鼠耳芥（Arabidopsishaller）中克隆到AhHMA4；Cobbett、Bernard等[8，19]從遏藍(lán)菜（Thlaspi caerulescens）中克隆到TcHMA4基因。植物基因組中有多個(gè)HMA基因存在，其蛋白在植物的根、莖、葉和細(xì)胞中的葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、液泡和質(zhì)膜上均有定位[20]。根據(jù)重金屬的底物特異性可以將P1B-ATPase分為兩個(gè)亞類：Zn2+/CO2+/Cd2+/Pb2+P1B-ATPase（Zn亞類）和Cu+/Ag+P1B-ATPase（Cu亞類），其中動(dòng)物只有Cu亞類[11，21]。植物中則包含這兩個(gè)亞類，如擬南芥AtHMAl-4屬于Zn亞類，而AtHMA5-8屬于Cu亞類[21]；水稻OsHMAl-OsHMA3屬于Zn亞類，OsHMA4-OsHMA9屬于Cu亞類[13]。

雖然HMA蛋白在植物中廣泛分布，但目前的研究仍僅局限于擬南芥，在重金屬超富集植物中沒(méi)有進(jìn)行系統(tǒng)全面的研究，而在藥用植物滇龍膽中至今未有報(bào)道。本研究根據(jù)3年生滇龍膽的轉(zhuǎn)錄組中GrHMA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，從滇龍膽幼葉中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)而擴(kuò)增到GrHMA基因序列，并進(jìn)行TA克隆、測(cè)序和序列分析；構(gòu)建GrHMA基因原核表達(dá)載體，在大腸桿菌Rosetta中進(jìn)行表達(dá)，使用SDS-PAGE檢測(cè)其蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示GrHMA基因?yàn)镠MA基因家族的成員，在37℃、1.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)，這將為滇龍膽GrHMA蛋白的純化、結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)，也為植物、動(dòng)物、微生物中HMA的研究提供參考。

1材料與方法

1.1植物材料

供試材料滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）種植于云南省農(nóng)科院藥用植物研究所種質(zhì)資源圃（25°08'04.50"N，102°46'15.05"E）。栽培地海拔1942m，年平均氣溫14.7℃，年平均降水量980～1050mm，極端高溫30.4℃，極端低溫-0.2℃。試驗(yàn)材料為滇龍膽長(zhǎng)勢(shì)良好的幼葉。

1.2菌株、載體、酶等主要試劑

工程菌E.coli Trans 5α、E.coli Rosetta（DE3）、RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I及異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、X-gal等均購(gòu)買于寶生物工程（大連）有限公司；高純質(zhì)粒小量制備試劑盒（離心柱型）、多功能DNA純化回收試劑盒均購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pGEX-4T-l由玉溪師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3引物設(shè)計(jì)

根據(jù)3年生滇龍膽轉(zhuǎn)錄組中GrHMA基因序列和原核表達(dá)載體pGEX-4T-l多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物GrHMABamH I-F：5'一GG -ATCCATGTCTATGGTGGAAGTTTTGG-3'：GrHMAXho I -R： 5'-CTCGAGTCACATAATAGAACAAG-CATGGG-3'。

1.4滇龍膽葉片總RNA的提取及GrHMA基因的擴(kuò)增

采用植物RNAiso for Polysaccharide-rich PlantTissue提取試劑盒，按照說(shuō)明書提取滇龍膽葉片的總RNA，參照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃ 3min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。利用BioTekeCorporaltion高純質(zhì)粒小量制備試劑盒回收RT-PCR產(chǎn)物，隨后將其連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli Trans5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于添加氨芐青霉素（Amp）（100mg/L）、IPTG、X-gal的LB平板上37℃培養(yǎng)12～16h后隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆搖菌并提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證正確后送出測(cè)序，即可獲得pMD19T-GrHMA重組載體。使用BarnH I和Xho I雙酶切pMD19T-GrHMA重組質(zhì)粒和pGEX一4T-l載體，回收目的基因和載體片段，按1：4（摩爾比）混合后經(jīng)Ligation SolutionI連接并轉(zhuǎn)化E.coli Trans Sa感受態(tài)細(xì)胞，涂布于添加100mg/L Amp的LB固體平板。次日隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆搖菌并提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證正確后測(cè)序，即可獲得pGEX-4T-1-GrHMA原核表達(dá)載體（圖1）。

1.5GrHMA的生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序?qū)rHMA蛋白進(jìn)行分析，應(yīng)用DNAMAN推測(cè)并比對(duì)氨基酸序列，利用在線軟件預(yù)測(cè)GrHMA蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸含量、等電點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和稀有密碼子等；應(yīng)用軟件Mega4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6pGEX-4T-1-GrHMA重組質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta中的表達(dá)

利用熱激法將pGEX-4T-l-GrHMA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（ DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落并接種于4mL含100mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。次日以l：100接種到新的不含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃200r/min培養(yǎng)至OD6≈0.6～0.8，在37℃條件下，加入IPTG（終濃度為lmmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并以pGEX-4T-l質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌（含1mmol/L IPTG）作對(duì)照。誘導(dǎo)0、1、2、4、6、8、18h后分別收集2mL菌液。常溫13000r/min離心lmin，棄上清，加入20μL5xSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100μL Milli-Qwater，震蕩混勻，煮水沸1 5min。室溫13000r/min離心5min，取20μL蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE（12%分離膠和4%濃縮膠）電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1滇龍膽GrHMA基因的克隆與分析

以滇龍膽cDNA為模板擴(kuò)增出的PCR結(jié)果表明，擴(kuò)增片段在500bp附近，是預(yù)期的目的片段（圖2）。pMD19T-GrHMA經(jīng)酶切驗(yàn)證連接正確，有明顯的、單一的目的條帶，且目的條帶與預(yù)期條帶的大小吻合。

cDNA序列測(cè)序結(jié)果分析表明，滇龍膽GrHMA基因（GenBank登錄號(hào)為KF922376）全長(zhǎng)429bp，編碼142個(gè)氨基酸。

使用在線軟件ExPASy ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)GrHMA蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示GrHMA蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為15.56kD，理論等電點(diǎn)為6.58，化學(xué)方程式為：C705H1069N179O205S7，不穩(wěn)定指數(shù)為31.78，脂肪族指數(shù)為71.14，總平均疏水性（grand average of hy-dropathicity，GRAVY）為-0.182，半衰期為30h。通常依據(jù)蛋白的GRAVY值來(lái)預(yù)測(cè)蛋白的疏水性，GRAVY值在2到-2之間，若為負(fù)值，則為親水蛋白；若為正值，則為疏水蛋白。GrHMA蛋白的GRAVY值為-0.182，說(shuō)明GrHMA為親水蛋白。

通過(guò)使用ExPASy ProtParam tool對(duì)GrHMA蛋白的氨基酸含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示GrHMA蛋白含有20種氨基酸，其中丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）的含量最高，為10.6%，其次是甘氨酸（Gly）、絲氨酸（Ser），為7.7%；谷氨酰胺（Gln）、色氨酸（Trp）含量最低，僅為0.7%。

采用InterProScan在線工具對(duì)GrHMA蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示GrHMA蛋白有6個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（圖3），主要是HMA（heavy met-al-associated domain，HMA）結(jié)構(gòu)域（IPR006121），分別為位于6～63位HMA（ PF00403）結(jié)構(gòu)域、3～67位HMA-2（PS50846）結(jié)構(gòu)域和1～70位HMA（heavy metal-associated domain）結(jié)構(gòu)域（SSF55008）。另外還有在IPR中沒(méi)有明確分類的結(jié)構(gòu)域，主要為位于2～69位未明確描述的結(jié)構(gòu)域（3.30.70.100）、1～70位Copper Transport Protein Atoxl-Related結(jié)構(gòu)域（PTHR22814）和1～70位OS04G0401000 Pro-tein（PTHR22814：SF44）結(jié)構(gòu)域。

選擇GrHMA氨基酸序列，在NCBI中進(jìn)行BLASTp分析，結(jié)果表明滇龍膽GrHMA蛋白屬于HMA超家族（圖4）。

GrHMA氨基酸序列與NCBI中經(jīng)比對(duì)后一致性較高的可可（Theobroma cacao）、擬南芥（Ara-bidopsis thaliana）、蓖麻（Ricinus communis）、蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）HMA氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明GrHMA蛋白與可可TcHMA同源性最高（74%），其次是擬南芥AtHMA，同源性為70%，與蒺藜狀苜蓿HMA蛋白的同源性較低（39%），見(jiàn)表1。

根據(jù)推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明GrHMA與TcHMA在同一進(jìn)化枝上，表明GrHMA與TcHMA蛋白的親緣關(guān)系較近（圖5）。GrHMA與NCBI中HMA已知序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果表明滇龍膽GrHMA蛋白保守性較強(qiáng)，與已知序列存在較高的同源性（圖6）。

利用ExPASy SignalP 4.0 Server在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)GrHMA蛋白進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，表明GrHMA不是分泌蛋白。

利用在線軟件Expasy中的TMHMM工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)GrHMA蛋白的跨膜螺旋區(qū)，結(jié)果表明GrHMA蛋白不是膜蛋白，無(wú)跨膜螺旋區(qū)。

使用SSpro在線軟件（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）分析GrHMA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲（C）占61.98%，β-折疊（E）占17.6%，α-螺旋（H）占20.42%。

利用CPHmodels 3.2 Server在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）預(yù)測(cè)GrHMA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖7），從圖中可以看到GrHMA的三級(jí)結(jié)構(gòu)形成了多個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，整個(gè)三維結(jié)構(gòu)呈“口袋”狀，表明該蛋白可能通過(guò)該“口袋”與金屬離子和DNA結(jié)合。

用ProtFun在線軟件基于已知的具有相似功能蛋白的搜索和比對(duì)，對(duì)GrHMA編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示GrHMA蛋白參與復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、能量代謝、翻譯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能性遠(yuǎn)高于其他功能，其可能性分別為0.204、0.184、0.167和0.118；另外其參與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性為0.009，這些數(shù)據(jù)能為GrHMA蛋白的后續(xù)研究提供參考。

對(duì)GrHMA基因進(jìn)行稀有密碼子分析（http：//molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html），結(jié)果表明GrHMA基因中不含稀有密碼子，因此可選用Rosetta菌或BL21進(jìn)行原核表達(dá)。

2.2原核表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定

利用BamH I和Xho I雙酶切pGEX-4T-l一GrHMA重組質(zhì)粒，可檢測(cè)到約429bp的片段（圖8），表明GrHMA基因已插入pGEX-4T-1載體中。對(duì)pGEX-4T-1-GrHMA重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示連入原核表達(dá)載體中的基因片段與目的序列一致，酶切位點(diǎn)處序列連接無(wú)誤，沒(méi)有移碼及堿基突變等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明已獲得正確的CrHMA原核表達(dá)載體。

2.3 SDS-PAGE分析

將pGEX-4T-l-GrHMA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）并誘導(dǎo)表達(dá)。37℃、IPTG終濃度為1mmol/L時(shí)分別誘導(dǎo)0、1、2、4、6、8、18h后，提取大腸桿菌總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示，插入外源片段的pGEX-4T-1一GrHMA重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在預(yù)期蛋白相對(duì)分子質(zhì)量41.56kD（包含GST蛋白）處有1條蛋白帶，而未誘導(dǎo)的pGEX-4T-l對(duì)照質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒均未出現(xiàn)該條帶，表明pGEX-4T-1-GrHMA重組質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)了GrHMA蛋白。誘導(dǎo)時(shí)間為8h時(shí)，蛋白表達(dá)量已很大，18h時(shí)達(dá)最大（圖9），表明相同條件下，一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量逐漸增加。

3討論

HMA是一個(gè)在植物中廣泛存在的蛋白家族，具有參與葉綠體Cu運(yùn)輸、Cu穩(wěn)態(tài)、毒性重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。植物中有關(guān)HMA蛋白純化的報(bào)道較少，其確切功能還有待進(jìn)一步研究。研究表明HMA可以調(diào)節(jié)植物穩(wěn)態(tài)，具有重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收、富集等作用。如Mills等[22]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtHMA4的T-DNA插入突變體對(duì)Cd、Zn離子濃度的升高敏感，AtHMA4在野生型酵母（Saccharomyces cere-visiae）中的異源表達(dá)可提高其對(duì)Cd離子的抗性，還能使Zn敏感型大腸桿菌zntA突變體存活；Andres-Colas等[23]研究發(fā)現(xiàn)AtHMA4在擬南芥中過(guò)表達(dá)可增加葉片中Zn和Cd的含量；Verret F等[24]研究發(fā)現(xiàn)AtHMA4在野生型酵母和Co超敏感突變體cotl中的表達(dá)能提高酵母對(duì)Co的敏感性。Papoyan等[17]研究表明遏藍(lán)菜TcHMA4在酵母中的過(guò)表達(dá)可提高其對(duì)重金屬離子的耐受性，并使其輸出Cd、Zn、Pb和Cu等重金屬；鼠耳芥AhHMA4在酵母中的過(guò)表達(dá)可降低細(xì)胞中Zn和Cd的含量，表明AhHMA4蛋白具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)Zn和Cd的作用。本研究利用RT-PCR技術(shù)，從滇龍膽幼葉中分離到GrHMA基因，序列分析表明GrHMA屬于HMA蛋白超家族。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，GrHMA與SIHMA26位于同一進(jìn)化枝，親緣關(guān)系最近；與CsHMA同源性最低，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。但要明確GrHMA蛋白在滇龍膽中的具體功能，必須從蛋白水平進(jìn)一步研究，而原核表達(dá)是目前最常用的研究蛋白結(jié)構(gòu)和功能的方法。

本研究首次從滇龍膽中克隆到GrHMA基因，成功將其連接到pGEX-4T-l原核表達(dá)載體上并順利在大腸桿菌表達(dá)菌Rosetta（DE3）中表達(dá)到目的蛋白。大腸桿菌中外源目的基因能否順利表達(dá)及表達(dá)效率的高低取決于原核表達(dá)載體、大腸桿菌菌株、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)劑濃度等。本研究在大腸桿菌Rosetta中進(jìn)行表達(dá)，獲得預(yù)期效果，在37℃、60r/min、IPTG終濃度為1mmol/L時(shí)，成功誘導(dǎo)了目的蛋白的表達(dá)。

本研究克隆了滇龍膽GrHMA基因，成功在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)并獲得融合蛋白。這為GrHMA蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入研究以及進(jìn)一步開發(fā)和利用植物HMA蛋白都具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

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