孟翠紅　張福元

摘要

[目的]利用紅三葉草固態(tài)發(fā)酵物飼喂肉仔公雞，分析紅三葉草固態(tài)發(fā)酵物對(duì)其免疫機(jī)能的影響。[方法] 選用1日齡健康艾維茵肉仔公雞600只隨機(jī)分為5組，在基礎(chǔ)日糧中添加0.1%、0.2%、0.3%紅三葉草固態(tài)發(fā)酵物（RSF）和紅三葉草提取物，研究發(fā)酵紅三葉草對(duì)肉仔公雞免疫機(jī)能的影響。[結(jié)果] 28日齡，0.1%RSF組肉仔雞T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)比對(duì)照組分別提高9.1%和8.3%（P<0.05）。在基礎(chǔ)日糧中添加0.1%、0.3%RSF和紅三葉草提取物均能顯著提高肉仔雞的胸腺指數(shù)（P<0.05）。在基礎(chǔ)日糧中添加0.1%RSF能顯著提高49日齡肉仔雞的脾臟指數(shù)（P<0.05）。 在基礎(chǔ)日糧中添加0.1%RSF和紅三葉草提取物均顯著提高22日齡肉仔雞的法氏囊指數(shù)（P<0.05）。[結(jié)論] 該研究可為利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵紅三葉生產(chǎn)飼料添加劑提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞紅三葉固態(tài)發(fā)酵；肉仔雞；免疫機(jī)能

中圖分類號(hào)S541+.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）36-12915-03

Abstract [Objective] The male broilers were fed with red cloversolid state fermentation to analyze their effects on the immune functions of male broilers. [Method] 600 onedayold healthy male Avian broilers were randomly divided into 5 groups. 0.1 %， 0.2%， 0.3% red cloversolid state fermentation （RSF） and red clover extract were added in the basal diet to study the effects of red cloversolid state fermentation on the immune functions of male broilers. [Result] The proliferation rates of T and B lymphocytes 28dayold broilers in 0.1% RSF group increased 9.1% and 8.3% than that in control group（P<0.05）. The thymus index of broilers could be significantly increased by adding 01%，0.3% RSF and red clover extract in the basal diet（P<0.05）. Adding 0.1% RSF in the basal diet could significantly increase the spleen index of 49dayold broilers（P<0.05）. Adding 0.1% RSF and red clover extract in the basal diet could significantly increase the fabricius index of 22dayold broilers（P<0.05）. [Conclusion] The research could provide theoretical basis for producing feed additives with solidstate fermentation products of red clover with Aspergillus oryzae.

Key words Red cloversolid state fermentation （RSF） ； Broilers； Immune function

紅三葉草，又名紅車軸、紅荷蘭翹搖等，是豆科三葉草屬多年生草本植物。紅三葉草在我國吉林、新疆、湖北山地、云貴高原等地區(qū)都有野生分布，在我國江淮流域、華南、西南等地區(qū)均有栽培，是我國長江流域以南及甘肅省高寒陰濕地區(qū)優(yōu)良的豆科牧草[1]。研究表明，紅三葉含有豐富的異黃酮類物質(zhì)（如芒柄花素、鷹嘴豆芽素A、紅車軸草素、大豆素等[2]），具有植物雌激素和抗氧化的生理活性功能[3-5]，能促進(jìn)動(dòng)物生長，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，調(diào)節(jié)動(dòng)物繁殖等[6-7]。

紅三葉草雖然含有豐富的異黃酮，但是由于植物細(xì)胞壁的高纖維結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙異黃酮從細(xì)胞內(nèi)滲出進(jìn)入腸道內(nèi)，從而使異黃酮還未滲出利用就已隨著糞便排出，使得異黃酮的利用率大大降低。米曲霉是梗孢科曲霉屬中常見的一個(gè)真菌種，是我國傳統(tǒng)釀造食品醬和醬油的生產(chǎn)菌種，也可用于生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等[8]。研究表明，米曲霉發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶的活性高[9]，利用米曲霉的這個(gè)特性發(fā)酵紅三葉草，制得集纖維素酶與異黃酮于一體的發(fā)酵物，既可使異黃酮在動(dòng)物體內(nèi)被充分利用，又有助于飼料中的纖維素和其他成分的消化。另外，用曲霉菌固態(tài)發(fā)酵紅三葉草產(chǎn)纖維素酶的研究表明，經(jīng)過發(fā)酵后的紅三葉內(nèi)異黃酮的滲出力提高了近1倍[10]。筆者利用紅三葉草固態(tài)發(fā)酵物飼喂肉仔公雞，通過對(duì)其免疫機(jī)能的影響研究，旨在為利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵紅三葉生產(chǎn)飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅三葉草購自甘肅岷海制藥有限公司，40目粉碎，測得總黃酮含量為2.2%。

紅三葉草固態(tài)發(fā)酵物（Redcloversolidstatefermentation，RSF）是利用米曲霉A.niger 3.3148菌株（產(chǎn)纖維素酶活高）在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵紅三葉草，14 d后低溫干燥制得。實(shí)際測得發(fā)酵物中含纖維素酶2 000 U/g、果膠酶1 560 U/g、糖化酶396 U/g、酸性蛋白酶196 U/g、米曲霉活菌數(shù)為5.3×106 cfu/g，總黃酮含量為2.3%。

紅三葉草提取物購自蘭州天萃生物技術(shù)有限公司，其主要成分為刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素A、染料木素及大豆素，總黃酮含量為98%。

BrduELISA試劑盒為Biochringer Mannheim公司產(chǎn)品，Percoll細(xì)胞分層液為Pharmacia公司產(chǎn)品，RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibcobrl公司產(chǎn)品，LPS（細(xì)菌脂多糖）和ConA（刀豆素A）為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物及基礎(chǔ)日糧

試驗(yàn)選用600只1日齡健康的艾維茵肉用公雛，平均體重為（40.39±1.48）g，將其隨機(jī)分為5個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40只雞。

基礎(chǔ)日糧以玉米-豆粕為主要原料，分生長前期（0～3 w）和生長后期（4～7 w）2個(gè)階段配制試驗(yàn)日糧，各處理組除添加物及劑量不同外，其他營養(yǎng)水平相同。各處理組基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平見表1～2。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共分5個(gè)試驗(yàn)組，分別為基礎(chǔ)日糧對(duì)照組（Ⅰ組）、基礎(chǔ)日糧+0.1%RSF（Ⅱ組）、基礎(chǔ)日糧+0.2%RSF （Ⅲ組）、基礎(chǔ)日糧+0.3%RSF （Ⅳ組）、基礎(chǔ)日糧+20 mg/kg紅三葉草提取物（Ⅴ組），試驗(yàn)期7 w。

1.4飼養(yǎng)管理

分3層籠養(yǎng)，雞舍采用暖氣供熱，第1周室溫為33～35 ℃，以后每天降溫0.5 ℃左右，從第5周開始環(huán)境溫度可保持在20～24 ℃。自由采食飲水。3日齡以前24 h光照，4～15日齡12 h光照，以后每周增加4 h光照時(shí)間，從第5周開始給予23 h光照和1 h黑暗至結(jié)束。光照強(qiáng)度第1～2周為10 lx，第3周可降到5 lx至出欄。7日齡時(shí)第1次注射新城疫弱毒苗進(jìn)行首次免疫，14日齡采用飲水進(jìn)行法氏囊疫苗免疫，21日齡采用飲水進(jìn)行新城疫弱毒苗二次免疫。試驗(yàn)期間，經(jīng)常觀察雞群采食飲水、糞便以及精神狀況，做好稱料和死亡等記錄。

1.5測定項(xiàng)目與方法

1.5.1

T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。于28日齡清晨從各處理組中取體重相近的健康雞3只，無菌心臟采血（外周）血，用肝素抗凝。采用Percoll細(xì)胞分層液來分離淋巴細(xì)胞。將制備好的淋巴細(xì)胞加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，50 μl/孔，以ConA和LPS分別作為T、B淋巴細(xì)胞絲裂源，濃度分別為45.0和22.5 μg/ml，每個(gè)處理3個(gè)復(fù)孔，置于40 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)60 h后，每孔加入10 μl Brdu標(biāo)記二抗及顯色，具體步驟按照試劑盒要求進(jìn)行，最后使用318MC酶標(biāo)儀測定T、B淋巴細(xì)胞增殖OD450 nm值。

1.5.2

免疫器官指數(shù)。22、36、49日齡清晨從各處理組隨機(jī)取體重均一的健康雞6只，進(jìn)行屠宰，摘取其左側(cè)胸腺、脾臟和法氏囊，用吸水紙吸干，剔除脂肪后稱量鮮重，計(jì)算免疫器官絕對(duì)重量及指數(shù)，以g/kg體重表示。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用SPSS （10.0） 軟件的ONEWAY ANOVA進(jìn)行方差齊次性檢驗(yàn)，再進(jìn)行F 檢驗(yàn)和LSD多重比較。

3 討論與結(jié)論

淋巴細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞）與機(jī)體的免疫有極密切的關(guān)系，B細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細(xì)胞，抗體主要是由漿細(xì)胞合成并分泌到血漿中的。T細(xì)胞本身雖不直接產(chǎn)生抗體，但它可與B細(xì)胞合作幫助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。Zyla等[10]發(fā)現(xiàn)添加黑曲霉菌絲體（A.niger FM）使法氏囊重增加，顯著減少了腸系膜派爾氏（Peyers）淋巴結(jié)。郭曉紅等用大豆異黃酮對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能及免疫性能的研究表明異黃酮能夠提高抗體水平和T淋巴細(xì)胞增殖[11]。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各試驗(yàn)組均顯著提高了B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，但隨著添加水平的提高有降低B淋巴細(xì)胞增殖的趨勢，添加0.1%和0.2%的RSF顯著提高了T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，說明RSF能調(diào)節(jié)肉仔雞免疫機(jī)能，增強(qiáng)了ConA和LPS對(duì)淋巴細(xì)胞刺激的反應(yīng)性，從而提高肉仔雞免疫力，這與邱榮斌等[12]研究結(jié)果相一致。

胸腺產(chǎn)生的胸腺素T細(xì)胞成熟的效應(yīng)因子，可促進(jìn)合成具有胸腺素依賴的IL2受體，調(diào)節(jié)IL2在免疫系統(tǒng)中的作用[13]。該試驗(yàn)中高濃度的RSF對(duì)肉仔雞生長初期胸腺指數(shù)影響顯著，但是隨著肉仔雞的生長，高濃度RSF對(duì)肉仔雞胸腺指數(shù)的影響降低，而低濃度RSF對(duì)胸腺指數(shù)的作用卻有所提高，說明高濃度RSF在肉仔雞生長初期能夠促進(jìn)胸腺素的產(chǎn)生，但是在生長后期反而抑制胸腺素的分泌。

脾臟是雞體內(nèi)最大的免疫器官，參與細(xì)胞免疫和體液免疫，脾臟重量的提高在某種程度上反映了動(dòng)物機(jī)體的免疫水平[14]。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.1%RSF顯著提高了49日齡脾臟指數(shù)，表明RSF降低死淘率作用原因之一是由于提高了脾臟器官重量，但突出表現(xiàn)在生長后期。0.2%RSF降低了脾臟器官重量，可能是因?yàn)槠湓谇捌谠斐傻拿庖邠p傷一直持續(xù)到生長后期所致。

法氏囊是雞重要的免疫器官，添加0.1% RSF提高前期成活率，可能與其提高法氏囊指數(shù)相關(guān)。36日齡和49日齡，各試驗(yàn)組肉仔雞法氏囊指數(shù)無顯著差異，這可能與法氏囊隨日齡的增長而逐漸萎縮有關(guān)。

RSF對(duì)肉仔雞免疫機(jī)能有調(diào)節(jié)作用，0.1%RSF提高了T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，較對(duì)照組分別提高9.1%和8.3%。在生長全期提高了肉仔雞胸腺指數(shù)，較對(duì)照組分別提高217%、26.2%和19.1%。在生長后期提高了肉仔雞脾臟指數(shù)，較對(duì)照組提高35.9%，說明添加0.1% RSF能增加脾臟器官重，生長后期表現(xiàn)突出。生長前期提高了肉仔雞法氏囊指數(shù)，對(duì)照組提高32.0%，生長后期各試驗(yàn)組在法氏囊指數(shù)上無顯著差異（P>0.05），這與法氏囊隨日齡增長逐漸萎縮有關(guān)。但隨著RSF添加水平的提高，并沒有進(jìn)一步提高肉仔雞免疫機(jī)能，添加0.2%RSF反而降低了49日齡脾臟指數(shù)，添加0.3%RSF沒有進(jìn)一步降低反而有所緩和。這可能是因?yàn)楦邉┝慨慄S酮造成了免疫抑制，而沒有進(jìn)一步降低可能是由于米曲霉菌的調(diào)節(jié)作用。

42卷36期孟翠紅等紅三葉草固態(tài)發(fā)酵物對(duì)肉仔公雞免疫機(jī)能的影響

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