黃丹瑩　葉能輝　莊楚雄

摘要應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）擴(kuò)增水稻OsGL12基因反義片段及基因自身的啟動(dòng)子，并分別克隆到 pUC19克隆載體上，得到含有OsGL12啟動(dòng)子+OsGL12反義片段的中間載體。對(duì)重組子進(jìn)行PCR檢測和酶切分析并測序，結(jié)果表明，長度分別為417和2 199 bp。將OsGL12啟動(dòng)子+OsGL12反義片段克隆到植物表達(dá)載體pCambia1380多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了該基因的植物反義表達(dá)載體pCamGL12。

關(guān)鍵詞水稻；GL12；啟動(dòng)子；反義表達(dá)載體

中圖分類號(hào)Q782文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）36-12818-03

AbstractOsGL12 antisense fragment and its promoter were amplified by PCR technique and cloned into the same pUC19 clone vector. The recombinant clones were detected by both PCR technique and restriction enzymes. The OsGL12 antisense fragment and promoter were sequenced. Results showed that the lengths of the both DNA fragments were 417 bp and 2199 bp， respectively. The OsGL12 promoter +OsGL12 antisense fragment from intermediate vector pUC19 was cut off and cloned into the multiple cloning sites of the plant expression vector pCambia1380， which can be used as antisense expression vector pCamGL12 for downregulation of OsGL12 gene.

Key wordsOryza sativa L； GL12； Promoter； Antisense expression vector

角質(zhì)層是覆蓋在陸生植物暴露于地面部分的一種疏水的屏障，主要作用是防止水份的丟失，避免紫外線輻射，降低塵埃、花粉和污染物的沉積[1]。角質(zhì)層主要結(jié)構(gòu)是蠟質(zhì)，GL1是有關(guān)植物蠟質(zhì)生物合成的基因，研究表明，在玉米、擬南芥中該基因突變能引起角質(zhì)層蠟質(zhì)組成的相應(yīng)改變[2]；GL1在水稻基因組中存在11 個(gè)基因位點(diǎn)，命名為 OsGL11OsGL111，已克隆了3個(gè)OsGL1基因[3]，但對(duì)于OsGL1基因家族在水稻中的生物學(xué)功能尚有很多不清楚。

反義RNA技術(shù)是一種調(diào)控基因表達(dá)的有效技術(shù)，已在植物基因工程研究中得到了廣泛應(yīng)用。通過互補(bǔ)的反義RNA附加到靶RNA鏈阻斷分子的功能，從復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上控制基因的表達(dá)和參與基因表達(dá)的調(diào)控，削弱相應(yīng)內(nèi)源目的基因的表達(dá)，即產(chǎn)生所謂“下降性調(diào)節(jié)”[4]。筆者通過構(gòu)建反義RNA載體，可用于之后的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻，觀測OsGL12基因由于部分表達(dá)受到抑制而產(chǎn)生的表型變化，推測研究OsGL12基因的功能，在抗逆角度上對(duì)進(jìn)一步研究和改善水稻的生物學(xué)性狀具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。粳稻品種中花11（ZH11），在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室內(nèi)栽培。取水稻葉片為材料經(jīng)液氮速凍后，于-70 ℃冰箱保存。

1.1.2載體與菌株。pUC19質(zhì)?？寺≥d體、轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1380、大腸桿菌菌株E.Coli.DH5α，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳工程實(shí)驗(yàn)室收藏。

1.1.3主要試劑與酶。

Amp、Kan、Xgal、IPTG、CTAB，SIGMA公司；DEPC及MOPS，AMRESCO公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖，BIORAD公司；TRIzolTM，Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶及連接酶，Takara公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

采用TRIZOL法[5]提取水稻總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得水稻cDNA，作為OsGL12基因片段的擴(kuò)增模板。擴(kuò)增體系按照Takara試劑盒要求進(jìn)行。

OsGL12基因反向片段PCR擴(kuò)增反應(yīng)，參數(shù)為94 ℃變性2 min 后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)，再進(jìn)行 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，28個(gè)循環(huán)，最后68 ℃延伸10 min。

采用CTAB法[6]抽提水稻基因組DNA，作為啟動(dòng)子克隆擴(kuò)增模板。啟動(dòng)子片斷PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃變性2 min 后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，再進(jìn)行 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，反應(yīng)28個(gè)循環(huán)，最后68 ℃延伸10 min。

1.2.2克隆載體的構(gòu)建。

OsGL12基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物用凝膠試劑盒純化回收，隨后用EcoRI/KpnI雙酶切之后，在連接酶作用下連接到克隆載體pUC19質(zhì)粒上。熱激法制備感受態(tài)細(xì)胞[5]。將連接產(chǎn)物電激轉(zhuǎn)化E.Coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞，電激后的菌體培養(yǎng)于1 ml SOC中（200 r/min，37 ℃），1 h后取適量菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基（含Amp100 μg/μl）上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選[6]。挑取白色單菌落，于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA雙酶切檢測，用M13系列通用引物對(duì)正確重組子進(jìn)行測序。用引物FP1和RP1擴(kuò)增的OsGL12基因反向片段，用KpnI/BamHI雙酶切后組裝到帶有啟動(dòng)子的pUC19克隆載體的下游，檢測方法同“1.2.1”。

1.2.3OsGL12反義表達(dá)載體組裝及克隆。

用EcoR I/BamH I將啟動(dòng)子+反義片段從pUC19載體上切下，與pCAMBIA 1380多克隆位點(diǎn)相連，組裝成反義表達(dá)載體pCamGL12（圖1）。電擊轉(zhuǎn)化E.Coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆用EcoR I/BamH I雙酶切鑒定，得到重組子。

3討論

3.1克隆載體和表達(dá)載體的選擇

pUC19是一種常用的高拷貝克隆載體，含有LacZ基因，重組pUC19的克隆轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有IPTG和XGal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，可通過藍(lán)/白法篩選，判斷載體中有無DNA片段的插入，適于DNA片段的克隆、測序、對(duì)外源基因進(jìn)行表達(dá)等。該研究首次采用pUC19為骨架構(gòu)建中間載體。選用的植物表達(dá)載體pCAMBIA1380 質(zhì)粒是雙元載體，含有潮霉素抗性基因和細(xì)菌卡那霉素抗性基因，能分別在細(xì)菌和植物中復(fù)制，適合在植物中表達(dá)。

3.2合適的啟動(dòng)子選擇

在植物反義表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用組成型啟動(dòng)子，如CaMV35S啟動(dòng)子、Ubiquitin啟動(dòng)子等。組成型啟動(dòng)子控制下外源基因在植物所有部位和所有發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)，但外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效表達(dá)，不但造成浪費(fèi)，往往還會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)的時(shí)空特異性改變。目前，特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來越受到人們的重視，自身的啟動(dòng)子可以與基因表達(dá)保持同步，能在植物中特異性地表達(dá)外源基因，提高反義抑制的效率[7]。該研究將克隆自水稻OsGL12基因以相反的方向插入到其特異啟動(dòng)子下游，目的是使細(xì)胞合成特異性的與其目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的反義RNA，使基因表達(dá)受到抑制。

3.3反義片段長度的選擇

反義RNA鏈的長度對(duì)抑制基因的效果有很大影響。在植物中，覆蓋整個(gè)cDNA的反義RNA能夠有效地抑制基因表達(dá)。然而，如果受抑制的基因是與發(fā)育有關(guān)的重要基因，完全的抑制會(huì)致死。反義RNA只要與靶mRNA的一小部分（<100堿基）結(jié)合即可達(dá)到調(diào)節(jié)作用，說明反義RNA 在發(fā)揮作用時(shí)并不要求序列的完全互補(bǔ)。反義片段的長度對(duì)抑制基因的效果沒有固定的規(guī)則，覆蓋全長或部分正義基因都能夠達(dá)到調(diào)節(jié)作用。該研究只采用約0.4 kb的反義序列，抑制基因表達(dá)的效果有待進(jìn)一步做遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

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