袁芳艷等

摘要[目的]克隆并在大腸桿菌中表達(dá)豬鏈球菌2型毒力因子gapdh基因，尋找與GAPDH互作的受體蛋白。 [方法]擴(kuò)增豬鏈球菌2型甘油醛3磷酸脫氫酶gapdh基因并構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET28agapdh。[結(jié)果]在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)了約41 kDa的融合蛋白GAPDH。Western blot試驗(yàn)說明GAPDH具有良好的免疫學(xué)活性。利用新西蘭大白兔制備抗GAPDH蛋白的多克隆抗體。運(yùn)用配體重疊技術(shù)，在 HeLa細(xì)胞中初步找到了一個與GAPDH蛋白作用的潛在受體蛋白。[結(jié)論]為進(jìn)一步研究豬鏈球菌2型的分子致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞2型豬鏈球菌；GAPDH；原核表達(dá)；多抗制備；受體

中圖分類號S852.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12821-04

Abstract[Objective] The aim was to study cloning，expression of streptococcus suis type 2 virulence factors gapdh gene and screening for protein with Hela cell. [Method]The glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase gapdh gene of Streptococcus suis serotype 2 （S.suis 2， SS2） was amplified by PCR， and inserted into the expression plasmid pET28a. [Result] About 41 kDa fusion protein was successfully expressed in escherichia coli BL21（DE3）. Good immunological activity of GAPDH protein was confirmed by western blot test.The polyclonal antibodies of rabbit anti GAPDH protein was preparated.Using ligand overlapping technology， a possible GAPDH protein receptor proteins was preliminaryly found in HeLa .[Conclusion] The study laid a foundation for further insights into the molecular pathogenesis of SS2.

Key wordsStreptococcus suis serotype 2； GAPDH； Prokaryotic expression； Receptor

豬鏈球菌病是一種由豬鏈球菌（Streptococcus suis）引起的豬呼吸道疫病，世界各地均有發(fā)生，也是影響我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病之一。2型豬鏈球菌病可引起豬腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎和敗血癥等，還可感染人發(fā)病并致死，是一種危險(xiǎn)的人畜共患病[1-2]。目前已證實(shí)在美、法、日、俄、印度、丹麥、荷蘭、加拿大等20多個國家和地區(qū)有該菌的存在[3]。在國內(nèi)最早由吳碩顯（1949）于上海郊區(qū)發(fā)現(xiàn)該病的散發(fā)病例，20世紀(jì)70年代發(fā)病增加，80年代后期發(fā)病更趨嚴(yán)重，在許多地方呈暴發(fā)流行。1998年7月中下旬，江蘇省局部再次暴發(fā)豬急性敗血型鏈球菌2 型傳染病，并造成人死亡[4-5]。隨后，在華南、西南、華東等地區(qū)有分離到該型菌的報(bào)道。2005年，四川省資陽地區(qū)暴發(fā)豬2型豬鏈球菌病，引起了人畜的死亡[6]。2型豬鏈球菌病不僅已成為我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的潛在威脅，而且還是一種廣受關(guān)注的人畜共患病。

2型豬鏈球菌甘油醛3磷酸脫氫酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase，GAPDH）是一種糖酵分解反應(yīng)酶，能將磷酸甘油醛（GAP）磷酸化，并產(chǎn)生1，3二磷酸甘油酯（DPG），主要存在于細(xì)菌胞漿中。關(guān)于哺乳動物GAPDH蛋白各種生物性能的鑒定已有較多報(bào)道[7]，包括運(yùn)輸和膜融合中的作用、微管組裝、核輸出和蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶/激酶反應(yīng)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)真核生物GAPDH與細(xì)胞附著有關(guān)，可能起到增強(qiáng)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的作用[8]。GAPDH的功能多樣性也存在于細(xì)菌中，特別在一些致病鏈球菌中。Madureira等[8]和Oliveira等[9]研究表明，在S.pyogenes、S.pneumoniae等的表面發(fā)現(xiàn)了GAPDH 蛋白。并用電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，鏈球菌表面確實(shí)存在GAPDH。通過gapdh的蛋白同源性證實(shí)，這些病原體包含一種高度保守的GAPDH蛋白，且與許多表面特異活動有關(guān)，這些活動包括作為細(xì)胞支架蛋白，進(jìn)行細(xì)菌與宿主細(xì)胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。

目前，對鏈球菌早期階段感染機(jī)制和細(xì)菌結(jié)構(gòu)方面的研究較少。細(xì)菌表面的多功能GAPDH蛋白可能與細(xì)菌毒力相關(guān)。但GAPDH表面定位機(jī)制尚不清楚。因此，尋找與GAPDH互作的受體蛋白對于揭示2型豬鏈球菌致病性具有重要意義。HeLa細(xì)胞是2型豬鏈球菌感染的模型細(xì)胞之一，能夠很好地用來研究鏈球菌感染過程中蛋白與蛋白之間的互作。筆者克隆并在大腸桿菌中表達(dá)了豬鏈球菌2型gapdh基因，制備了兔抗多克隆抗體，應(yīng)用配體重疊技術(shù)，在HeLa細(xì)胞中初步找到一個與GAPDH互作的蛋白，這為進(jìn)一步研究GAPDH在豬鏈球菌2型致病過程中的黏附機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞。

豬鏈球菌2型（Streptococcus suis serotype 2，SS2）由動物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）菌株、HeLa細(xì)胞由動物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體pMD18T、表達(dá)載體pET28a購自大連寶生物公司。

1.1.2試驗(yàn)動物。

新西蘭大白兔購自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.3主要藥品及試劑。

LA Taq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶（400 u/ml），限制性內(nèi)切酶BamHI、SalI均購自大連寶生物公司。蛋白酶K、卡那霉素、氨芐青霉素購自Sigma公司。LB、TSA和TSB培養(yǎng)基購自Difco公司?？扇苄缘鞍?×HisGAPDH純化試劑盒購自Novagen公司。DNA回收試劑盒購自上海生工生物工程公司。新生牛血清（NCS）購自杭州四季青有限公司。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗豬IgG、羊抗兔IgG購自SBA公司。

1.1.4抗生素。

氨芐青霉素：用滅菌蒸餾水配制成儲存濃度50 mg/ml，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

卡那霉素：用滅菌蒸餾水配制成儲存濃度25 mg/ml，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5細(xì)菌基因組DNA提取試劑。

TE：10 mmol/L TrisHCl（pH 8.5），1 mmol/L EDTA，50 mg/ml的溶菌酶，2 mol/L NaCl，10% SDS，20 mg/ml的蛋白酶K，酚∶氯仿∶異戊醇（100∶99∶1），異丙醇，75%乙醇。

1.1.6大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備試劑。

TB：10 mmol/L Pipes，55 mmol/L MnCl2，15 mmol/L CaCl2，250 mmol/L KCl。除MnCl2外的其他成分先混合溶解，用KOH調(diào)pH至6.7，再加入MnCl2溶解，過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1鏈球菌基因組DNA提取。

接種鏈球菌于5 ml TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床（220 r/min）培養(yǎng)過夜，取1 ml培養(yǎng)物于1.5 ml 離心管中，室溫8 000 r/min 離心5 min，棄上清，0.5 ml TE洗滌2次，沉淀重新懸浮于1 ml TE中。然后加入6 μl 150 mg/ml的溶菌酶，37 ℃作用2 h。再加2 mol/L NaCl 50 μl，10% SDS 110 μl，20 mg/ml的蛋白酶K 3 μl，50 ℃作用3 h或37 ℃過夜。均分到2個1.5 ml離心管，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提2次，用0.6倍體積的異丙醇沉淀，再用75%乙醇洗滌，自然干燥后，溶于500 μl ddH2O中備用。

1.2.2PCR擴(kuò)增gapdh基因。

1.2.2.1 引物。

參考GenBank中g(shù)apdh 基因序列，通過DNA star 軟件分析，顯示該片段有抗原結(jié)合位點(diǎn)，利用DNAman 軟件自行設(shè)計(jì)引物，分別添加酶切位點(diǎn)BamHI和SalI及保護(hù)性堿基。引物由大連寶生物工程有限公司合成。

上游引物（P1）：GCCGGATCCATGGTAGTTAAAGTTG；

下游引物（P2）：GCCGTCGACTTATTTAGCAATTTTTG。

1.2.2.2PCR反應(yīng)。

95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3GAPDH多克隆抗體的制備。

大量提取純化的融合蛋白，用Eppendor公司的Biospectrometer儀測定提純蛋白濃度。如蛋白濃度太低，可將蛋白溶液裝入透析袋中，用蔗糖進(jìn)行濃縮。配得濃度為0.5～1.0 mg/ml。

將純化的GAPDH蛋白與等體積完全弗氏佐劑混勻并乳化完全，在家兔后頸部分多點(diǎn)皮下注射，免疫劑量為1.0 mg/只。14 d后，將純化的蛋白與等體積不完全弗氏佐劑混勻并乳化完全，并進(jìn)行加強(qiáng)免疫。以后，每14 d加強(qiáng)免疫一次，共免疫4次。從第2次免疫開始，每次免疫前，采血分離血清，檢測抗體效價(jià)，直至抗體水平達(dá)到試驗(yàn)要求。心臟采血，分離血清，置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4細(xì)胞總蛋白提取。

收集培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，向其中加入NP40緩沖液后冰浴30 min。超聲波破碎，30 s/次，10次。沸水煮5 min，冰浴5 min。10 000 r/min離心10 min。取上清并用1.5 ml EP管分裝，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5細(xì)胞受體蛋白的初步尋找。

將所提取的HeLa細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜。設(shè)置陰性對照試驗(yàn)。電轉(zhuǎn)后封閉。試驗(yàn)組封閉后與含有GAPDH的 Reaction Buffer封閉過夜，陰性對照不與之封閉。其后過程同Western blot，所用一抗為“1.2.3”制備的GAPDH多克隆抗體，二抗為1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG。

2結(jié)果與分析

2.1gapdh基因的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果（圖1），出現(xiàn)一條約為1 011 bp的條帶。擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期大小一致。

3討論

3.1gapdh基因克隆與表達(dá)

該研究對gapdh全基因進(jìn)行表達(dá)，將gapdh克隆到pET28a表達(dá)載體中。將重組質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)了約41 kD的融合蛋白，與預(yù)期大小相符。對最佳誘導(dǎo)時(shí)間和最佳IPTG濃度進(jìn)行摸索后，表明重組細(xì)菌在誘導(dǎo)3 h，IPTG終濃度為1 mmol/L時(shí)，融合蛋白的表達(dá)量最高。進(jìn)一步Western blot試驗(yàn)表明，融合蛋白能與鏈球菌2 型陽性血清反應(yīng)，具有免疫學(xué)活性。

IPTG（異丙基硫代βD半乳糖苷）是β半乳糖苷酶活性的誘導(dǎo)物，它通過與乳糖操縱元的阻遏蛋白相結(jié)合，使得乳阻遏蛋白的空間構(gòu)像發(fā)生變化，導(dǎo)致四聚體解聚成單體，從而失去與操縱子特異性緊密結(jié)合的能力，最終解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以轉(zhuǎn)錄合成利用乳糖的酶類。因IPTG對各種載體的誘導(dǎo)活性有差異，因此，選擇表達(dá)載體時(shí)，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的最終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。融合表達(dá)時(shí)在選擇外源DNA同載體連接反應(yīng)時(shí)，對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。

3.2pETgapdh融合蛋白的純化

對重組細(xì)菌通過超聲波進(jìn)行裂解，并將裂解液上清和沉淀分別進(jìn)行SDSPAGE。結(jié)果表明，融合蛋白在上清和沉淀中均有存在，但主要位表達(dá)在裂解液上清中，這說明重組表達(dá)細(xì)菌在37 ℃條件下誘導(dǎo)時(shí)，主要以可溶性蛋白的形式表達(dá)于上清中。這對該蛋白的進(jìn)一步純化非常有利。為了制備GAPDH多克隆抗體，該研究對融合蛋白用試劑盒進(jìn)行了純化。純化效果較理想，得到的條帶大小與目的蛋白一致。純化所需的緩沖液要新鮮配制，過柱時(shí)最好讓一種緩沖液流盡后再加另一種，以讓液體與柱中的凝膠顆粒有充分地接觸和反應(yīng)時(shí)間。由于融合蛋白存在于上清中，故需先對細(xì)菌裂解液進(jìn)行處理，得到上清濾出物。將上清濾出物過柱以純化融合蛋白。Change Buffer中含有鎳離子，可以吸附于柱中凝膠顆粒上，同時(shí)也可與6×His GAPDH 結(jié)合。上清中的GAPDH便吸附到凝膠顆粒上，再用Elution Buffer從凝膠顆粒上洗脫下來。

3.3關(guān)于細(xì)胞受體

該研究采用配體重疊技術(shù)（ligandoverlay approach）尋找GAPDH在HeLa細(xì)胞中的受體。以HeLa細(xì)胞為模型，提取HeLa細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDSPAGE。通過毛細(xì)滲透和電場作用，使聚丙烯酰胺凝膠上的HeLa細(xì)胞總蛋白充分轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，在一抗與靶蛋白作用之前，試驗(yàn)組硝酸纖維素膜與含有GAPDH蛋白的Reaction Buffer封閉過夜，而陰性對照不與之封閉。顯色后，將試驗(yàn)組與陰性對照進(jìn)行比較，當(dāng)試驗(yàn)組出現(xiàn)條帶而對照組中沒有出現(xiàn)條帶時(shí)，且經(jīng)3次或3次以上具有很好的重現(xiàn)性，可初步認(rèn)定該條帶可能為所要尋找的受體蛋白。

該研究經(jīng)過多次試驗(yàn)，已經(jīng)找到了一條符合上述要求的條帶。但這只是研究過程中的一個初步發(fā)現(xiàn)。因?yàn)镾DSPAGE和Western blot試驗(yàn)結(jié)果受很多因素影響，除以上差別外，還有一些主觀和客觀上的差別。在無法消除這些差異的情況下，比較可取的措施是在不同條件下進(jìn)行大量重復(fù)。如果重復(fù)后，絕大多數(shù)試驗(yàn)組在相同的位置出現(xiàn)同一條帶，而對照組在該位置沒有出現(xiàn)帶，則可以初步判定該條帶可能為尋找的受體蛋白。如要進(jìn)一步研究確證該蛋白就是GAPDH受體蛋白，必須將該蛋白進(jìn)行質(zhì)譜測序，并通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等方法加以驗(yàn)證。

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