樊云芳　陳曉軍　曹有龍

摘要以寧夏枸杞為試驗(yàn)材料，利用同源克隆技術(shù)，設(shè)計(jì)簡并引物，克隆得到一個(gè)新的甜菜堿醛脫氫酶基因。該基因全長cDNA為1 527個(gè)堿基，編碼508個(gè)氨基酸，編碼區(qū)兩側(cè)翼分別具有5′UTR （47 bp）和3′UTR （ 129 bp ）。在推導(dǎo)的氨基酸序列中，含有醛脫氫酶所具有的高度保守的十肽（VTlElGGKSP）以及與酶功能有關(guān)的半胱氨酸殘基（C）。進(jìn)化分析表明，它與番茄甜菜堿醛脫氫酶親緣關(guān)系最近，與其他藜科植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該基因的獲得有助于理解枸杞這一鹽生植物耐鹽機(jī)理，為培育新的耐鹽枸杞奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞寧夏枸杞；同源克隆；BADH2

中圖分類號S567.1+9文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2014）35-12798-05

Abstract A new gene of Betaine Aldehyde Dehydrogenase （BADH）， named LbBADH2， was obtained by RACE technology in Lycium barbarum. The full cDNA of LbBADH is consist of 1 527 base pairs and encode 508 aa.， 5′UTR （47 bp） and 3′UTR （129 bp ） locating both side of it. A high conserved decapeptide sequence ‘VTLELGGKSP and Cys， which are related to the activity of enzyme， are found in putative amino acid among all BADH. The evolutional analysis showed that LbBADH2 is closer with Solanum lycopersicum than others plant in genetic relationship. The obtaining of LbBADH2 will help understanding the mechanism of salt tolerance and lay theoretical foundation for developing new salttolerance variety in Lycium barbarum.

Key words Lycium barbarum； Homocloning； BADH2

枸杞（Lycium barbarum L.）屬于茄科枸杞屬落葉灌木，也是其中唯一一屬鹽生植物，其根系發(fā)達(dá)，具有抗旱、耐鹽堿、耐寒、耐瘠薄的特點(diǎn)，主要種植于輕度鹽漬化地區(qū)，是鹽漬化土地改良的先鋒植物。在當(dāng)前西部生態(tài)建設(shè)和中藥材基地建設(shè)中，枸杞具有很高的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會價(jià)值[1- 2]。

甘氨酸甜菜堿（簡稱甜菜堿）是甘氨酸的衍生物，被認(rèn)為是最好的滲透調(diào)節(jié)劑。在植物體

內(nèi)，甜菜堿由膽堿經(jīng)兩步氧化生成，催化第2步反應(yīng)的是甜菜堿醛脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase，BADH）[3]。目前BAHD已經(jīng)從鹽節(jié)木（Halocnemum strobilaceum）[4]、鹽穗木（Halostachys caspica）[5]、堿蓬（Suaeda liaotungensis）[6-7]、梭梭（Haloxylon ammodendron）[8]、菠菜（Spinacia oleracea）[9]、濱藜（Atriplex centralasiatica）[10]、山菠菜（Atriplex hortensis）[11]、甜菜（Beta vulgaris）[12]、鹽爪爪（Kalidium foliatum）[13]等藜科植物，小麥（Triticum aestivum）[14]、水稻（Oryza sativa）、短芒大麥草（Hordeum brevisubulatum）等禾本科植物以及油菜（Brassica napus）[15]等其他植物中分離克隆。在鹽生植物寧夏枸杞中雖然已經(jīng)克隆了BADH1[16]，但在枸杞復(fù)雜的耐鹽生理過程中是否存在除BAHD1外的甜菜堿醛脫氫酶尚未見報(bào)道。筆者以寧夏枸杞葉片為試驗(yàn)材料，利用同源克隆技術(shù)分離克隆到BADH2，從進(jìn)化角度分析其在耐鹽生理過程中的保守性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。

2013年5月，在寧夏枸杞種質(zhì)資源圃中，取寧杞1號幼嫩枸杞根、莖、葉片、花等植物材料，低溫冰盒保藏后帶回實(shí)驗(yàn)室，然后置于-70 ℃冰箱中備用，隨后提取總RNA。

1.1.2載體與試劑。

RNA提取試劑盒為SV Total RNA Isolation System（Promega）； RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為mPromII Reverse Transcriptase（Promega）、離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為Wizard SV Gel and PCR Cleanup System（Promega）；T連接載體試劑盒為pGEMT easy II Vector（Promega），5′RACE和3′RACE試劑盒均為Takara公司產(chǎn)品，Taq DNA聚合酶與DNA分子量marker為Tiangen公司產(chǎn)品；引物由北京奧科公司合成；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取。按Promega 公司SV Total RNA Isolation System試劑盒操作指南進(jìn)行。

1.2.2總cDNA的反轉(zhuǎn)錄。

按Promega 公司mPromII Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行。取2 μg枸杞葉片總RNA，以O(shè)ligo dT為引物，進(jìn)行總cDNA反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為20 μl，MMlV RT buffer 4 μl，總RNA 2 μl，dNTP 2 μl，反轉(zhuǎn)錄酶MMlV 1 μl，Oligo （dT）16 1 μl，RNA酶抑制劑RNasesin 0.5 μl，加DEPC處理的H2O 至20 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，3 ℃ 3 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3BADH基因核心序列的PCR擴(kuò)增 。

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的BADH基因序列（GenBank登錄號分別為FJ228482、BT013588、FJ514799、DQ497233、DQ923617）設(shè)計(jì)一對簡并引物，從枸杞葉片cDNA擴(kuò)增該基因的核心片段。上游引物為P1（CGNCARYVTTTCATYGAYGG），下游引物為P2（TTCYCCDAGYTCDCGBCCAAA NCCRCTRCG），預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 392 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包含10×buffer 2.5 μl，dNTP（2.5 mmol/μl）1.5 μl，上、下游引物（10 μmol/μl）各1 μl，Taq聚合酶（5 U/μl）1 μl，總cDNA（1 μg/μl）1 μl，加ddH2O至25 μl。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s、50 ℃退火40 s、72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。

1.2.4BADH基因3′RACE擴(kuò)增。

根據(jù)其他已發(fā)表物種的BADH2基因cDNA序列設(shè)計(jì)BADH2基因的3′ RACE的引物P3（CTGAAGAGG AAGCCATTGAG）和P4（TTCTCAGTCAGGGTGTGTC），按照Takara 3′Full RACECore Set Ver.2.0說明書進(jìn)行3′ RACE擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為362 bp。

1.2.5BADH基因5′RACE擴(kuò)增。

根據(jù)其他已發(fā)表物種的BADH2基因cDNA序列設(shè)計(jì)5′RACE引物P5（TCAGGATGTGAAACCAAAGGAGAACCAG）和P6（GAGGTAATAGATGCCATTTCAGACGGCT），按照Takara 5′Full RACE Kit 說明書進(jìn)行5′ RACE 擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為628 bp。

1.3克隆與測序

1.3.1BADH2基因完整序列的測序與拼接。所有基因片段送北京天根生物公司測序。將核心序列、3′ RACE測序結(jié)果與5′ RACE 測序結(jié)果進(jìn)行拼接，所得即為BADH2基因cDNA 的完整序列。

1.3.2BADH2基因cDNA 完整ORF的PCR擴(kuò)增。

根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計(jì)BADH2基因完整ORF序列的上游引物P7（GAAAAACTCATATCAGTAGCATTTAGC）和下游引物P8（GCTCTTAAAGATGAAATAAACAGAAGAGG），以枸杞葉片反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序確認(rèn)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 527 bp。

1.4BADH2基因的進(jìn)化分析

采用www.ncbi.nlm.nih.gov中的BlAST軟件、DNAMAN7.0，對編碼BADH2蛋白基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；采用MEGA 5.05軟件繪制進(jìn)化樹，計(jì)算方法采用Neighborjoining方法，Bootstrap 設(shè)置為1 000[9]。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年

2結(jié)果與分析

2.1LbBADH2 cDNA序列的獲得

以枸杞葉片cDNA為模板，設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增LbBADH2保守核心序列，擴(kuò)增片段大小為1 392 bp（圖1），與預(yù)期大小一致，測序獲得LbBADH2保守核心序列；3′ RACE擴(kuò)增片段大小為362 bp（圖2），與設(shè)計(jì)一致，測序后獲得LbBADH2 3′序列；5′ RACE結(jié)果擴(kuò)增片段大小為628 bp（圖4），與設(shè)計(jì)一致，測序后獲得LbBADH2 5′序列；將 LbBADH2保守核心片段、3′片段、5′片段序用DNAMAN（V7.0）生物軟件進(jìn)行拼接，重新設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增該基因全長序列，擴(kuò)增大小

3討論

在植物中BADH基因是以小的多基因家族的形式存在。在甜菜BADH基因的研究中，發(fā)現(xiàn)在單倍體基因組中至少有2個(gè)相關(guān)序列[19]。在水稻中也發(fā)現(xiàn)有大量乙醛酸脫氫酶（AlDH） 基因家族[20]，大麥中含有一個(gè)2～3個(gè)成員小的多基因家族[21]；胡楊[22]、甘菊[23]、三角葉濱藜[24]均克隆到該基因的2個(gè)成員。 這種多個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄本不同剪切方式造成，甘菊2個(gè)基因可能是由于此方式造成。但從枸杞2個(gè)基因比對和進(jìn)化分析看出，推測它們是由不同基因所編碼。這2個(gè)基因在應(yīng)答鹽脅迫時(shí)，不同的響應(yīng)方式及表達(dá)模式還需進(jìn)一步研究。

在已報(bào)道的BADH氨基酸序列中，存在2種有關(guān)該酶蛋白定位的信號肽。一種是N 端信號肽，其氨基酸序列為QlF IDGE，被認(rèn)為是定位于葉綠體的信號，但該信號肽缺乏典型性；另一種是C 端信號肽，氨基酸序列為SKl，是定位于過氧化物酶體中的信號。從目前研究結(jié)果看，將具有C 端信號肽SKl的BADH定位于過氧化物酶體已無爭議，但對具有不典型N 端信號肽的BADH定位問題尚有爭論。在LbBADH2推導(dǎo)的氨基酸序列中，含有醛脫氫酶所具有的高度保守的十肽（VTlElGGKSP）以及與酶功能有關(guān)的半胱氨酸殘基（C）。這些殘基可能包含NAD+結(jié)合位點(diǎn)和酶催化位點(diǎn)[17]。 在5′端含有不典型的信號肽QlFIDGE，表明該酶可能定位于葉綠體中[18]

提高農(nóng)作物（大豆[25]、玉米[26]）、牧草（苜蓿[27]）耐鹽性的BADH基因轉(zhuǎn)化已有報(bào)道，該研究所克隆的寧夏枸杞BADH2基因?yàn)槟望}植物定向培育提供了選擇空間。

參考文獻(xiàn)

[1]

毛桂蓮，許興.枸杞耐鹽突變體的篩選及生理生化分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2005，25（2）：275-280.

[2] 孟鳳，郁松林，鄭強(qiáng)卿，等.甜菜堿與植物抗逆性關(guān)系之研究進(jìn)展 [J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（4）：225-228.

[3] 梁崢，駱愛玲.甜菜堿和甜菜堿合成酶 [J].植物生理學(xué)通訊，1995，31（1）：1-8.

[4] 高天鵬，王春燕，徐紅偉，等.鹽生植物鹽節(jié)木甜菜堿醛脫氫酶基因的克隆及表達(dá) [J].植物研究，2013，33（3）：317-324.

[5] 關(guān)波，胡有貞，張富春，等.鹽穗木甜菜堿醛脫氫酶基因（BADH）的克隆及其在鹽脅迫下的表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)通訊，2010（1）：47-50.

[6] 李秋莉，張毅，尹輝，等.遼寧堿蓬甜菜堿醛脫氫酶基因（BADH）啟動子分離及序列分析 [J].生物工程學(xué)報(bào)，2006，22（1）：77-81.

[7] 王三紅，陶建敏，張紅梅，等.鹽地堿蓬甜菜堿合成酶基因的克隆及植物共表達(dá)載體的構(gòu)建（英文） [J].西北植物學(xué)報(bào)，2007（2）：215-222.

[8] 石磊，甘曉燕，陳虞超，等.梭梭甜菜堿醛脫氫酶基因克隆及序列分析 [J].西北植物學(xué)報(bào)，2010，30（2）：223-228.

[9] 舒衛(wèi)國，艾萬東，陳受宜，等.菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因全序列分析 [J].科學(xué)通報(bào)，1997，42（22）：2441-2445.

[10] 陳秀娟，王峻嶺，趙彥修，等.中亞濱藜甜菜堿醛脫氫酶基因的表達(dá)特性[J].植物生理學(xué)報(bào)，2001，27（4）：309-312.

[11] 肖崗，張耕耘，劉鳳華，等.山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因研究[J].科學(xué)通報(bào)，1995，40（8）：741-745.

[12] TABUCHI T，OKADA T，TAKASHIMA Y，et al.Transcriptional response of glycinebetainerelated genes to salt stress and light in leaf beet [J].Plant Biotechnol，2006，23：317-320.

[13] 曾幼玲，幸婷，蔡忠貞，等.鹽生植物鹽爪爪甜菜堿醛脫氫酶基因的克隆及在鹽脅迫下的BADH基因的表達(dá) [J].云南植物研究，2007，29（1）：79-84.

[14] 李永華，尚玉萍，楊芳絨，等.小麥甜菜堿醛脫氫酶基因在煙草中的轉(zhuǎn)化及表達(dá)[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，41（1）：12-14，20.

[15] 柴靚，李浩杰，蒲曉斌，等.甘藍(lán)型油菜甜菜堿醛脫氫酶基因（BnBADH-1）的克隆與真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J].分子植物育種，2013（1）：53-61.

[16] 田躍勝，許潔婷，唐克軒，等.枸杞甜菜堿醛脫氫酶基因全長cDNA的克隆與表達(dá)分析[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2010，31（2）：48-52.

[17] WERETILNYK E A，HANSON A D.Betaine aldehyde dehydrogenase from spinach leaves：purification，in vitro translation of the mRNA，and regulation by salinity [J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1989，271（1）：56-63.

[18] WERETILNYK，E A，HANSON A D.Molecular cloning of a plant betainealdehyde dehydrogenase，an enzyme implicated in adaptation to salinity and drought [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1990，87（7）：2745-2749.

[19] MCCUE K F，HANSON A D.Saltinducible betaine aldehyde dehydrogenase from sugar beet ：cDNA cloning and expression[J].Plant Molecular Biology，1992，18（1）：1-11.

[20] KOTCHONI S O，JIMENEZ-lOPEZ J C，GAO D.Modeling-dependent protein characterization of the rice aldehyde dehydrogenase （AlDH） superfamily reveals distinct functional and structural features [J].PloS One，2010，5（7）：11516.

[21] MANABU LSHITANI，TOSHIHIDE NAKAMURA，SEUNG YOUN HAN et al.Expression of the betaine aldehyde dehydrogenase gene in barley in response to osmotic stress and abscisic acid [J].Plant Molecular Biology，1995，27（2）：307-315.

[22] 劉佳琪，楊雪，李迪，等.胡楊甜菜堿醛脫氫酶基因的功能分化 [J].生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（3）：329-339.

[23] 劉振林，曹華雯，夏新莉，等.甘菊BADH基因cDNA的克隆及在鹽脅迫下的表達(dá)[J].武漢植物學(xué)研究，2009，27（1）：1-7.

[24] 何曉蘭，侯喜林，吳紀(jì)中，等.三角葉濱藜甜菜堿醛脫氫酶（BADH）基因的克隆及序列分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（1）：15-19.

[25] 劉志華，姜振峰，王宏燕，等.轉(zhuǎn)BADH基因大豆對鹽堿土壤根際微生物量碳氮的影響[J].作物雜志，2014（3）：50-53.

[26] 邸宏，周成生，曾興，等.轉(zhuǎn)BADH基因耐鹽堿玉米對根際土壤酶活性的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014（4）：25-29.

[27] 張麗，甘曉燕，石磊，等.新疆大葉紫花苜蓿BADH基因轉(zhuǎn)化體系的研究[J].草地學(xué)報(bào)，2014（2）：359-365.