王東　王剛　饒力群

摘要 [目的]建立快速、有效檢測農(nóng)產(chǎn)品中玉米赤霉醇（ZER）殘留量的方法。[方法]試驗以人工合成的ZER為包被原，ZER為競爭半抗原，兩者與一定量的抗玉米赤霉醇單克隆抗體反應，應用間接競爭ELISA法建立玉米赤霉醇單克隆抗體快速檢測農(nóng)產(chǎn)品中ZER含量的半定量檢測，同時對該ELISA試劑盒進行了調(diào)試。[結果]試驗建立檢測ZER的ELISA方法，其最適包被濃度為1∶5 000，抗體最適工作濃度為1∶2 500，酶標二抗的最適工作濃度為1∶5 000。試劑盒檢測限為0.5 ng/ml，添加回收率在70.0%～116.0%，變異系數(shù)小于20%，在2～8 ℃條件下可保存90 d。[結論]該試驗建立的方法可應用于玉米、小麥、高粱等中的玉米赤霉醇的檢測，應用前景廣闊。

關鍵詞 玉米赤霉醇；單克隆抗體；間接競爭；檢測限；ELISA

中圖分類號 S513 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）20-06764-03

Development and Application of Zeranol and ELISA Kit in Agricultural Products

WANG Dong et al

（College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128）

Abstract [Objective] To establish a method for rapidly and effectively detecting ZER in agricultural products. [Method] With ZER package as original， ZER as hapten for competition， both with a certain amount of resistance to zeranol monoclonal antibody response. The indirect competitive ELISA method was used to establish the zeranol monoclonal antibody rapid detection ZER content in the semiquantitative detection of agricultural products. At the same time the ELISA kit was tested. [Result] ELASA method was established to detect ZER， the optimal concentration of package， IgGHRP are 1∶5 000，the optimal concentration of antibody is 1∶2 500. The detection limit of kit is 0.5 ng/ml， adding recovery rate 70.0%-116.0%， variation coefficient is less than 20%， which can be stored for 3 months under 2-8 ℃. [Conclusion] The method can be used in detection of ZER in maize， wheat， sorghum with broad prospect.

Key words Zeranol； Monoclonal antibody； Indirect competition； Detection limit； ELISA

玉米赤霉醇（ZER）屬雌性激素[1]，具有維持副性征和代蛋白同化效應，除用于一般治療用途外，還作為生長促進劑應用于反芻動物（尤其是牛羊）[2]。20世紀90年代末，人們發(fā)現(xiàn)食用含有玉米赤霉醇殘留的農(nóng)產(chǎn)品會引起人體性機能紊亂，影響第二性征的正常發(fā)育，在外部條件誘導下還可能致癌。其次，ZER排出動物體外后，還可經(jīng)飲水和食物造成二次污染。1998年，歐盟禁止將玉米赤霉醇等激素類藥物應用于畜禽養(yǎng)殖，我國農(nóng)業(yè)部第235號公告明確規(guī)定玉米赤霉醇禁用于所有食品，判定檢測標準為2 ng/ml[3]。目前國際上農(nóng)產(chǎn)品中玉米赤霉醇殘留檢測方法[4]主要有液-質聯(lián)用法和氣-質聯(lián)用法及液相色譜-串聯(lián)質譜測定方法。此類儀器檢測方法，準確度高，精密度好，可作為藥殘檢測的最終確證，但其樣本前處理復雜、檢測時間長、需要昂貴的儀器設備，且對試驗操作人員要求高。同酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA）比較，后者具有靈敏度高、特異性強、儀器化程度低和樣品前處理相對簡單，對試驗人員要求也相對容易掌握等優(yōu)點，特別適于殘留現(xiàn)場監(jiān)控和大樣本篩查，故建立一種準確、快速的ELISA檢測方法極為重要。筆者開發(fā)的玉米赤霉醇ELISA檢測試劑盒可應用玉米、小麥、高粱以及飼料等中的玉米赤霉醇的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

包被原：玉米赤霉醇與卵清蛋白偶聯(lián)的抗原。

抗體：玉米赤霉醇與蛋白質偶聯(lián)抗原的單抗。

稀釋液：抗原稀釋液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液；

抗體稀釋液為0.05 mol/L含有0.05 ml牛血清白蛋白、保護劑的磷酸鹽緩沖液；

封閉液為含有0.5%酪蛋白、1%小牛血清、5‰防腐劑（疊氮鈉）的磷酸鹽緩沖液；

酶標記物稀釋液為含有5%小牛血清和保護劑的緩沖液。

酶標二抗：羊抗鼠抗抗體，杭州隆基生物技術有限公司。

底物顯色液：2 mol/L四甲基聯(lián)苯胺和4 mol/L過氧化氫。

終止液：2 mol/L濃硫酸。

空白牛尿樣本來源于湖南省飼料監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 反應原理。

該試驗采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物玉米赤霉醇與微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗玉米赤霉醇的抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含玉米赤霉醇的含量呈負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)即可得出殘留物玉米赤霉醇的含量[5]。

間接競爭ELISA反應歷程為：1包被過程→2包被原與抗原競爭抗體→3酶與結合在微孔上的抗體結合→4酶催化底物顯色（圖1）。

1.2.2 試驗條件體系建立。

在文獻[6]的基礎上，利用棋盤法測定包被原、稀釋液等。在文獻[7-9]的基礎上，確定試驗條件、試劑盒的靈敏度和準確度的驗證、試劑盒的保存等試驗。試劑盒標準曲線的建立[7]，如圖2所示。

2 結果與分析

2.1 最適包被液濃度分析

由表1可見，隨著包被原濃度的降低，IC50的變化幅度不大，但最大吸光值降低。1∶20 000稀釋時最大吸光值較低。當做1∶5 000稀釋（濃度為0.2 ng/ml）的包被原IC50和吸光值均較好（根據(jù)朗伯-比爾定律以及試驗經(jīng)驗得出：最大吸光值理想范圍為1.500～2.000）。

2.2 單抗稀釋液的選擇

試驗結果表明（表2），選擇最大吸光值較大，IC50較低，添加回收率較高的較符合的單抗稀釋液作為試劑盒的單抗稀釋液，故選擇單抗稀釋液D。

2.3 包被條件的確定

試驗結果表明（表3），選擇最大吸光值較大，IC50較低，空白本底較低，添加回收率較高的包被條件作為試劑盒的包被條件，4 ℃過夜雖IC50較低，但最大吸光值和添加回收率也相應降低，說明包被原未能很好地吸附于酶標板上；37 ℃溫育1 h，再4 ℃過夜與37 ℃溫育2 h，再4 ℃過夜差異不顯著，從節(jié)省時間考慮，故選擇37 ℃溫育1 h，再4 ℃過夜（表3）。

2.4 封閉時間的確定

試驗結果顯示（表4），選擇最大吸光值較大，IC50較低，空白本底較低，添加回收率較高的封閉條件作為試劑盒的封閉條件，封閉30 min雖空白本底較低，但IC50升高，可見非特異性反應增加；封閉60 min與封閉120 min差異不顯著，從節(jié)省時間考慮，故選擇封閉60 min。

2.5 試劑盒靈敏度分析

評價競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗反應靈敏度的方法，常用的有IC50抑制濃度（指零標準溶液吸光度值的50%處所對應的藥物濃度）和最低檢測限，兩者值越低說明試劑盒的靈敏度越高。最低檢測限的定義有多種，一般規(guī)定20份空白樣品或零標準品的測定平均值加3倍標準差為試劑盒的最低檢測限。最低檢測限與樣品的種類、采樣地區(qū)和樣品的前處理方法等密切相關，可作為評價檢測方法靈敏度的指標，但不宜作為檢驗試劑盒靈敏度的指標，而IC50不受樣本影響，其值相對恒定，常用作評價競爭ELISA試劑盒靈敏度的指標。

IC50值與抗體和酶結合物的質量及檢測方法有關，分別測定20次標準曲線的IC50抑制濃度（表5），玉米赤霉醇通過20次空白樣本（空白樣本來自獸藥監(jiān)察所，已用液質聯(lián)用儀器檢測確定）。

2.6 試劑盒特異性分析

表6結果表明，玉米赤霉醇單抗與β玉米赤霉醇、α玉米赤霉烯醇、β玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的交叉反應率分別為100.0%、36.25%、52.73%、0.67%、74.36%、53.70%；與己烯雌酚、雌二醇、睪酮、克倫特羅的交叉反應率均小于0.1%。ZER單抗與其結構相似的同系物有一定的交叉反應，但與功能相似的激素類藥物無交叉反應。

2.7 試劑盒準確度分析

由表7可見，以10、21、35 ng/ml 3個濃度添加空白牛尿中，測得回收率在59.5%～111.6%，變異系數(shù)在6.4%～17.5%，符合準確度的測定標準。

2.8 試劑盒保存試驗分析

同一批次試劑盒在37 ℃條件下保存時間0、1、3 d的變化，以及在2～8 ℃保存時間0、14、30、90、180 d的試驗結果見表8。

3 討論

在此次試驗研究過程中，反應體系中的有機溶劑、反應環(huán)境pH及離子強度、反應溫度等的影響，集中表現(xiàn)在對各種

工作液的篩選工作上，試驗研究工作主要對最適包被濃度的

確定、稀釋液對單抗和酶標二抗稀釋的倍數(shù)確定、樣品溶液與單抗溶液體積比例的確定、封閉液的確定等工作，為后期體系的建立提供必要的試驗要素。試驗研究對反應時間、反應物的量進行了篩選，為了達到ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒最終快速，在保證試驗結果的準確性前提下，最終確定了單抗反應時間和酶標二抗反應時間均為1 h；單抗與標準品（或樣品）的體積比為50 μl∶50 μl。

添加溶液比例、包被原、單抗、酶的濃度以及包被液和封閉液的選擇直接影響試劑盒的IC50、靈敏度和精確度。在綜合考慮原材料的用量試驗效果以及對原料的合理應用條件下，經(jīng)過試驗對照，包被原選擇1∶5 000，單抗選擇1∶2 500稀釋，酶選用1∶5 000稀釋，一般濃度提高IC50提高、靈敏度降低。試驗操作反應的適宜溫度以及時間與試驗結果的最佳值密切相關，如反應溫度偏低，反應時間偏少，試劑盒處于極端條件下（如放在貼著冰箱壁，試劑凍傷）等都會造成試驗的OD值偏低，繼而影響試驗數(shù)值的準確性，經(jīng)過試驗對比驗證確定：單抗反應時間為60 min，酶標二抗反應時間為60 min，底物顯色條件37 ℃顯色10 min以及試劑盒的保存試劑盒在2～8 ℃條件下可保存90 d。

該試劑盒檢測限為0.5 ng/ml，添加回收率在70.0%～116.0%，變異系數(shù)小于20%，在2～8 ℃條件下可保存90 d。整個體系反應時間為130 min，比儀器方法（氣相、液相方法等）節(jié)省很多時間，玉米赤霉醇ELISA快速檢測方案試驗體系建立成功，達到了檢測體系快速、定性半定量的目的并具有很廣泛的前景。

參考文獻

[1] 蔣學之.環(huán)境雌激素對人類健康的潛在影響[J].中國公共衛(wèi)生，1997，13（4）：251-252.

[2] 林書康，游存華.牛羊增重劑——玉米赤霉醇[J].黃牛雜志，1992（4）：62-66.

[3] 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.農(nóng)業(yè)部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[R].2002-12-24.