曹冰　龍翔宇　肖小虎　唐朝榮

摘 要 從橡膠樹中克隆2個NADP-ME（蘋果酸酶）基因的全長cDNA，分別命名為HbNADP-ME1和HbNADP-ME2。HbNADP-ME1和HbNADP-ME2 cDNA全長分別為2 428、2 139 bp，分別編碼643、593個氨基酸組成的蛋白，二者的氨基酸序列一致性高達(dá)87.25%，且分別與蓖麻和楊樹的一個NADP-ME序列具有較高的序列一致性。2個HbNADP-ME蛋白都含有典型的植物NADP-ME蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，均富含亮氨酸（Leu），同屬于非分泌型穩(wěn)定蛋白。2個HbNADP-ME基因在橡膠樹不同組織中的表達(dá)存在明顯差異，在根中的表達(dá)量最高，種子和花中的表達(dá)量次之；另外，HbNADP-ME1基因在膠乳中受機(jī)械傷害有下調(diào)表達(dá)趨勢，HbNADP-ME2基因在膠乳中受割膠處理也表現(xiàn)出下調(diào)表達(dá)趨勢，而低溫脅迫則顯著誘導(dǎo)2個基因在葉片和根中的表達(dá)。結(jié)果說明，HbNADP-ME基因可能參與橡膠樹的抗逆應(yīng)答及代謝調(diào)控（包括膠乳代謝調(diào)控）。此結(jié)果為深入揭示橡膠樹中NADP-ME基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；NADP-ME；基因克?。槐磉_(dá)分析；脅迫；代謝

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

NADP-蘋果酸酶（NADP-ME）是廣泛存在于原核及真核生物中的一類氧化脫羧酶，它在二價金屬離子存在的條件下，與NADP+結(jié)合，催化蘋果酸氧化脫羧生成丙酮酸鹽和二氧化碳，而NADP+則被還原為NADPH，是生物體內(nèi)蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶之一[1-2]。在植物中，根據(jù)行使功能的不同NADP-ME可以分為光合型NADP-ME和非光合型NADP-ME。光合型的NADP-ME主要參與C4植物光合作用，它存在于C4植物維管束鞘細(xì)胞的葉綠體中或存在于景天酸代謝植物（CAM）的細(xì)胞質(zhì)中，催化蘋果酸氧化脫羧從而為Rubisco酶的光合碳固定提供CO2[3-9]；非光合型的NADP-ME在C3、C4和CAM植物中均存在[10]，根據(jù)亞細(xì)胞定位的不同，可將其分為質(zhì)體型和細(xì)胞質(zhì)型2種類型[9]。近幾十年來，眾多的研究結(jié)果表明，植物NADP-蘋果酸酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢、穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)的pH以及保持植物根系的離子吸收平衡等方面起重要作用[10-11]。此外，也有不少該酶參與植物抗逆過程的報(bào)道。例如：在干旱及低溫脅迫時，小麥的NADP-ME基因受誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，同時NADP-ME的活性也明顯增強(qiáng)，有利于細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)控和抵御干旱、低溫脅迫，說明NADP-ME活性的增加是其自身形成的一種對外界環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，但其具體的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚[12-16]。橡膠樹是一種多年生的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，是天然橡膠的主要來源，而天然橡膠的合成代謝和膠乳產(chǎn)量受多種因素影響，尤其是割膠和多種生物（病蟲害）、非生物脅迫（低溫、干旱、臺風(fēng)等）。同時，膠乳pH調(diào)控是影響膠乳糖代謝和膠乳再生的一個關(guān)鍵因素[18-19]。鑒于NADP-ME在植物抗逆應(yīng)答和細(xì)胞pH調(diào)控上的雙重作用，分離橡膠樹NADP-ME基因并研究其表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)，將有助于了解NADP-ME基因在橡膠樹膠乳pH調(diào)節(jié)以及抗逆脅迫應(yīng)答過程中的作用。本研究擬從橡膠樹中克隆包含完整編碼區(qū)的NADP-ME基因cDNA序列，并進(jìn)一步對其推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，同時利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析相關(guān)基因的組織表達(dá)特性和在割膠、機(jī)械傷害、低溫和乙烯利處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為巴西橡膠樹（Heavea brasiliensis），品系為熱研7-33-97，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所試驗(yàn)場二隊(duì)。

1.2 菌株與試劑

菌種Escherichia coli JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverAidTM First Stand cDNA Systhesis Kit購自Fermentas公司；pMD18-T Vector Ligase Kit購自Takara公司；Trans-HiFi DNA polymerase購自Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Sigma公司；DNase I、實(shí)時熒光定量染料SYBR-Premix ExTaqTM II（Perfect Real Time）和T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司；引物合成和測序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成；其它生化試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 材料處理 基因組織特異性熒光定量表達(dá)分析的材料（膠乳、樹皮、葉片、種子、雄花和雌花）來自于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場三隊(duì)的正常開割樹，根則是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源圃華于偉老師贈送的熱研7-33-9組培苗根。葉片不同發(fā)育時期的材料（用于solexa測序和qRT-PCR驗(yàn)證）為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源圃1年生熱研7-33-9嫁接苗。割膠和機(jī)械傷害處理均選用8 a樹齡達(dá)到開割標(biāo)準(zhǔn)的未開割橡膠樹，采用S/2 d3割制。割膠處理收集開割后前5個刀次的膠乳，以第1刀為對照，依次標(biāo)記為1、2、3、4、5；機(jī)械傷害處理是在割線下方3～4 mm處沿割線每隔5 cm釘一個圖釘；選用正常開割2年的橡膠樹進(jìn)行乙烯利處理，按每棵樹1.5 g的量將1.5%乙烯利均勻的涂抹于割線及其上部約2 cm的割面上。機(jī)械傷害和乙烯利處理均在采膠前0、3、12、24 h共4個時間點(diǎn)進(jìn)行，以0 h為對照，于同一時間采集膠乳；采集死皮程度分別為<30%、30%～60%、60%～90%這3種情況的橡膠樹膠乳，以健康樹為對照。同一實(shí)驗(yàn)的橡膠樹均來自相同林段，每個處理選取5株，割膠后單株收集2 mL膠乳，與等體積RNA提取緩沖液混勻后帶回實(shí)驗(yàn)室；低溫處理在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源圃的人工氣候室進(jìn)行，幼苗移入裝有營養(yǎng)液的250 mL三角瓶（錫箔紙包裹）中進(jìn)行處理，處理溫度為5 ℃，全程光照，設(shè)置0、3、12、24 h時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)設(shè)5個重復(fù)，將處理苗在不同時間放入培養(yǎng)箱，最后一起取材，每個時間點(diǎn)選3株苗取葉片、樹皮和根，3種組織液氮凍存，提取RNA。

1.3.2 總RNA提取與cDNA第一鏈合成 膠乳總RNA的提取采用本實(shí)驗(yàn)室的改良方法[20]，其它組織的RNA提取方法按照常規(guī)方法進(jìn)行。用Fermentas公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，操作步驟參照使用說明書。

1.3.3 巴西橡膠樹NADP-ME基因全長cDNA克隆

搜索本實(shí)驗(yàn)室所建立的橡膠樹膠乳EST數(shù)據(jù)庫，獲得2個HbNADP-ME基因的拼接序列，以此設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增這2個HbNADP-ME基因的系列片段，然后根據(jù)擴(kuò)增得到的序列分別設(shè)計(jì)3′-RACE和5′-RACE的引物擴(kuò)增3′和5′端未知片段，具體方法參照本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文獻(xiàn)[21]。根據(jù)所得2個NADP-ME基因的3′和5′端序列和測序驗(yàn)證序列，利用GENETYX軟件進(jìn)行序列拼接，獲得2個基因的全長cDNA拼接序列。根據(jù)所得的全長拼接序列在3′和5′末端設(shè)計(jì)一對引物，使用Trans-HiFi DNA polymerase進(jìn)行全長cDNA的PCR擴(kuò)增，引物終濃度均為0.5 μmol/L，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收純化目的條帶，連接到pMD18-T載體上并轉(zhuǎn)化至JM109，菌落PCR鑒定后，分別挑選3個陽性單克隆送往公司測序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 利用軟件DNAMAN 5.22對2個HbNADP-ME基因核苷酸序列進(jìn)行翻譯及氨基酸序列多重比對；利用在線軟件Expasy（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行氨基酸組成、穩(wěn)定系數(shù)、親水系數(shù)、蛋白分子量和等電點(diǎn)分析；利用在線軟件iPOSORT（http：//psort.hgc.jp/form.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；信號肽分析采用在線軟件http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；蛋白質(zhì)親水性分析則采用在線軟件http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl；其他物種的氨基酸序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫，采用MEGA5.10軟件，以鄰近法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbNADP-ME基因的克隆及序列分析

利用在線軟件分析2個基因所編碼蛋白的理化特性，HbNADP-ME1和HbNADP-ME2的氨基酸序列一致性高達(dá)87.25%，通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)，均含有NADP-ME的5個高度保守氨基酸結(jié)構(gòu)域[10]；這2個蛋白均富含亮氨酸（Leu）。HbNADP-ME1蛋白的理論等電點(diǎn)為6.67，不穩(wěn)定系數(shù)為39.51，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.142；HbNADP-ME2蛋白的理論等電點(diǎn)為6.24，不穩(wěn)定系數(shù)為38.91，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.137，均屬于穩(wěn)定型的親水蛋白。此外，跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，這2個蛋白均是非分泌型的。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)HbNADP-ME基因編碼的氨基酸序列，在NCBI非冗余蛋白序列庫中進(jìn)行同源檢索和比對分析，獲取來自不同植物的16條NADP-ME蛋白序列。將HbNADP-ME1和HbNADP-ME2與這16條NADP-ME的蛋白序列（共18條蛋白序列）進(jìn)行多重比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。18條NADP-ME蛋白序列可明顯地被分為2個類群，其中HbNADP-ME1與同樣來自大戟科的蓖麻（Ricinus communis）的一個NADP-ME（AAF73006.1）的親緣關(guān)系最近，氨基酸序列一致性高達(dá)98.6%；HbNADP-ME2與同為高大喬木的毛果楊（Populus trichocarpa）的一個NADP-ME（XP_002324450.1）親緣關(guān)系最近，氨基酸序列一致性高達(dá)99.2%，總的來看，在同一分化類群內(nèi)，NADP-ME蛋白的親緣關(guān)系與其相應(yīng)來源的植物物種進(jìn)化關(guān)系趨于一致。從進(jìn)化樹還可以看出，HbNADP-ME1和擬南芥AtNADP-ME4同聚于第一群，HbNADP-ME2和擬南芥AtNADP-ME1同聚于第二群，而根據(jù)已有報(bào)道，擬南芥AtNADP-ME4屬于非光合型質(zhì)體型的NADP-ME、AtNADP-ME1屬于非光合型細(xì)胞質(zhì)型的NADP-ME[24]。HbNADP-ME1和HbNADP-ME2的亞細(xì)胞定位和信號肽在線分析結(jié)果顯示：它們定位在細(xì)胞膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及葉綠體膜上的可能性都不到1%，同時這2個蛋白均屬于非分泌型蛋白。因此，筆者推測HbNADP-ME1可能與AtNADP-ME4一樣屬于非光合型質(zhì)體型NADP-ME，而HbNADP-ME2可能屬于非光合型細(xì)胞質(zhì)型NADP-ME。

2.3 HbNADP-ME在不同組織和葉片不同發(fā)育時期的表達(dá)分析

2.4 HbNADP-ME基因在不同脅迫條件下的表達(dá)模式分析

HbNADP-ME1基因的表達(dá)變化并不明顯，而HbNADP-ME2在前3刀呈現(xiàn)明顯的下調(diào)表達(dá)，此后維持穩(wěn)定；隨著傷害時間的遞增，HbNADP-ME1有下調(diào)表達(dá)趨勢，而HbNADP-ME2無明顯變化；在低溫（5 ℃）處理的葉片中，HbNADP-ME1和HbNADP-ME2的表達(dá)均呈現(xiàn)先明顯上升（3 h），接著明顯下降（12 h），而后又明顯上升的趨勢（24 h）；在低溫（5 ℃）處理的根中，2個基因表達(dá)均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，其中HbNADP-ME1表達(dá)在3 h的時候達(dá)到頂峰，而HbNADP-ME2的表達(dá)則在12 h的時候才達(dá)到頂峰。但是，2個HbNADP-ME基因在膠乳中的表達(dá)幾乎都不受乙烯利處理的影響，在不同死皮程度橡膠樹中2基因的表達(dá)差異也不明顯。以上結(jié)果表明，割膠、傷害以及低溫的脅迫對HbNADP-ME1和HbNADP-ME2的表達(dá)產(chǎn)生不同程度的影響，推測它們也有可能參與橡膠樹的生物和非生物脅迫應(yīng)答過程。

3 討論與結(jié)論

植物抗逆性與“細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)控系統(tǒng)”有著密切關(guān)系，其中NADP-ME基因就是該系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)成員之一[25]，在植物生長發(fā)育及抗逆脅迫過程中扮演著重要角色。NADP-ME廣泛的參與不同的代謝途徑，通常認(rèn)為NADP-ME為各種細(xì)胞合成反應(yīng)提供還原力NADPH。例如，在產(chǎn)油微生物油脂合成代謝調(diào)控中，NADP-ME持續(xù)為脂肪合成酶進(jìn)行鏈延伸提供NADPH[26]，是控制蘋果酸降解的關(guān)鍵酶。NADP-ME在催化蘋果酸氧化脫羧的過程中生成丙酮酸鹽、二氧化碳和NADPH，對于保持植物細(xì)胞的滲透勢，穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)的pH和保持植物根系的離子吸收平衡起著重要作用；同時，NADP-ME基因參與多種脅迫應(yīng)答機(jī)制，是一種脅迫相關(guān)的基因，在植物適應(yīng)干旱、高鹽和高滲透等逆境環(huán)境中起重要作用[16-17，27-28]。

橡膠樹天然橡膠合成和膠乳再生代謝過程均需要大量的NADPH，同時胞液pH的變化也是其代謝過程中重要的生理生化調(diào)控手段，pH的改變將影響代謝關(guān)鍵酶（尤其是膠乳蔗糖代謝關(guān)鍵酶——轉(zhuǎn)化酶）的活性[18-19，29]，本文克隆的橡膠樹NADP-ME基因有助于進(jìn)一步了解膠乳代謝調(diào)控的分子機(jī)制。雖然不同植物中的NADP-ME可能執(zhí)行不同的生理功能，但它們的氨基酸序列卻高度一致，均含有5個高度保守氨基酸結(jié)構(gòu)域，這5個結(jié)構(gòu)域是植物NADP-ME蛋白典型的特征，可能與NADP+的結(jié)合有關(guān)[10]。本文所得到的2個HbNADP-ME家族成員與其他植物NADP-ME氨基酸序列的一致性也很高，其中HbNADP-ME1與蓖麻的一個NADP-ME氨基酸序列一致性高達(dá)98.6%，HbNADP-ME2與毛果楊的一個NADP-ME氨基酸序列一致性高達(dá)99.2%，同時它們與水稻、玉米、擬南芥、大麥、小麥、蘋果等不同植物的NADP-ME氨基酸序列一致性也均在80%以上。本研究發(fā)現(xiàn)2個HbNADP-ME基因均在橡膠樹根中的表達(dá)量最高（圖5），這與煙草、擬南芥和玉米中的研究結(jié)果一致[4，24，30]，推測可能是由于土壤的酸堿度對根的影響最直接最明顯，長期進(jìn)化導(dǎo)致大部分植物的NADP-ME基因均在根中高表達(dá)。此外，這2個基因在花中的表達(dá)量也比較高，可能與花中花青素的合成需要大量的NADPH有關(guān)[31]。2個HbNADP-ME基因在葉和根中的表達(dá)顯著受低溫誘導(dǎo)，這與其它植物中NADP-ME基因的表達(dá)受干旱、低溫、紫外線等多種非生物脅迫調(diào)控的報(bào)道一致[13-16]，表明HbNADP-ME基因可能在橡膠樹的逆境脅迫應(yīng)答與適應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮作用。當(dāng)植物受到外界環(huán)境脅迫時，將產(chǎn)生過多的超氧自由基，其自身pH將發(fā)生變化，需要大量的NADPH參與脅迫滲透調(diào)節(jié)和脅迫清除相關(guān)物質(zhì)的合成，進(jìn)而參與維持正常的生理生化過程，NADP-ME在此過程中發(fā)揮重要作用[32]。

綜合前人以及本文的研究結(jié)果，筆者推測所克隆得到的HbNADP-ME1和HbNADP-ME2基因可能參與橡膠樹多種組織的代謝過程，包括割膠過程中的膠乳代謝，同時這2個基因還可能參與了橡膠樹逆境脅迫應(yīng)答，尤其在橡膠樹抗低溫脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果為深入揭示橡膠樹中NADP-ME基因的功能奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：趙軍明