韓立敏

摘要 酚酸類成分是丹參的一大類活性成分，具有重要的生理意義，從丹參酚酸類成分的生理活性、生源途徑、生源途徑關(guān)鍵酶基因研究等方面進(jìn)行了歸納總結(jié)，提出了有待深入研究解決的問題，為丹參酚酸成分的生物合成及其調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 丹參；酚酸類成分；生物合成；關(guān)鍵酶基因

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）20-06562-03

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，以其干燥根及根莖入藥，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等功效[1]。丹參的生理活性成分按其溶解性的不同分為兩大類：一類是脂溶性成分，另一類是水溶性成分。丹參酮 I、丹參酮 IIA、丹參酮 IIB、隱丹參酮、丹參酸甲酯、紫丹參素等均屬脂溶性成分；丹參的水溶性成分主要是指一些酚酸類化合物，包括丹參素、紫草酸、丹酚酸B和迷迭香酸等[2]。鑒于中醫(yī)傳統(tǒng)用藥方法是用其水煎劑，即丹參的水溶性部位，因此，研究丹參水溶性成分的生物合成及其代謝調(diào)控具有重要意義，成為近年來的研究熱點(diǎn)。

1 丹參酚酸類化合物的藥理活性

丹參水溶性酚酸類成分具有重要藥理作用，尤其是迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A和丹酚酸B，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，丹參的水溶性成分具有抗炎、抗菌、抗血栓、改善微循環(huán)、促進(jìn)組織恢復(fù)、抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基等多種生理活性，在抗肝臟損傷、抗動(dòng)脈粥樣硬化等方面具有一定的療效[3-5]。因此，丹參酚酸類成分是極具價(jià)值的藥用資源，蘊(yùn)藏著巨大的市場(chǎng)潛力，為更好地利用這一資源，闡明它們的生物合成途徑并應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)具有重要意義。

2 丹酚酸類成分的生物合成途徑

早在1993年，PETERSEN等[6]利用彩葉草的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，第一次比較全面地闡述了迷迭香酸的生源途徑及途徑上相關(guān)酶，丹參中的主要水溶性酚酸類成分在結(jié)構(gòu)上與其具有相似性，大部分都是在迷迭香酸的結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步衍生化得到，因此在生源途徑上也應(yīng)有一定的關(guān)聯(lián)，但具體的生源途徑尚不完全清楚。目前普遍認(rèn)為，丹參酚酸類次生代謝物主要合成于兩條代謝途徑——苯丙烷代謝途徑和迷迭香酸代謝途徑（圖1A）[7]，ZHANG等[8]研究了丹參毛狀根在茉莉酸甲酯和真菌提取物處理下丹酚酸合成途徑關(guān)鍵酶基因的響應(yīng)情況，認(rèn)為酪氨酸途徑與迷迭香酸的合成相關(guān)性更大[8]。2012年上海第二軍醫(yī)大學(xué)邸鵬[9]利用13C同位素標(biāo)記動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的方法對(duì)迷迭香酸生源途徑進(jìn)行了重新評(píng)估，認(rèn)為咖啡酰CoA與4羥基苯乳酸在丹參迷迭香酸合成酶（SmRAS）催化下生成咖啡酸4羥基苯乳酸，顛覆了之前人們對(duì)此途徑的認(rèn)識(shí)（圖1B）。2013年，陜西學(xué)前師范學(xué)院植物次生代謝課題組對(duì)丹參酚酸類成分的合成途徑再次進(jìn)行了修正，SmRAS催化4香豆酰CoA與丹參素合成4香豆酰3，4二羥基苯乳酸，而后在丹參細(xì)胞色素P450酶（SmCYP98A14）的作用下轉(zhuǎn)化為迷迭香酸，再經(jīng)過多步反應(yīng)生成丹酚酸B（圖1C）[10]。

關(guān)于丹參酚酸類成分生源途徑，人們認(rèn)識(shí)比較清楚的是迷迭香酸的上游，但迷迭香酸代謝通路還有不確定的步驟，即SmRAS底物和產(chǎn)物，對(duì)此仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。丹酚酸B如何由迷迭香酸轉(zhuǎn)化而來目前仍不清楚，研究成果很少，從迷迭香酸到丹酚酸B的代謝通路研究有待突破。

3 丹參酚酸類化合物生物合成途徑上相關(guān)酶基因

3.1 苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL）

苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonialyase EC 4.3.1.24）是催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，是苯丙烷類化合物代謝的關(guān)鍵酶和限速酶。在丹參迷迭香酸生源途徑中 PAL 是丹參從初生代謝途徑向次生代謝途徑進(jìn)入的位點(diǎn)酶和限速酶[11]。

SONG等[12]將丹參苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL）干涉后發(fā)現(xiàn)丹參中迷迭香酸和丹酚酸 B 的含量顯著下降，且植株的表型發(fā)生變化，從而證實(shí)了 PAL 在迷迭香酸合成過程中的重要性。之后，人們對(duì)丹參苯丙氨酸解氨酶基因的功能及其表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了大量研究。MeJA處理可以顯著提高SmPAL酶活性，促進(jìn)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中迷迭香酸（RA）的生物合成[13]。適宜濃度的 Ca2+處理可以通過影響迷迭香酸合成途徑中關(guān)鍵酶 PAL 活性從而顯著提高丹參培養(yǎng)細(xì)胞中迷迭香酸的合成積累量[14]。水楊酸（SA） 處理可有效誘導(dǎo)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中PAL活性升高以及丹酚酸B 的合成與積累[15]，但SmPAL受熱脅迫影響表達(dá)量下降[16]。

圖1 丹參酚酸類成分的生物合成途徑

3.2 肉桂酸4羥化酶基因（SmC4H）

肉桂酸 4羥化酶（cinnamate 4monooxygenase EC 1.14.13.11 ）是一種 P450 單加氧酶，是第一個(gè)被克隆并確定了功能的植物 P450[17]。其催化苯丙烷途徑中4肉桂酸向4香豆酸轉(zhuǎn)化，催化反式肉桂酸對(duì)位羥基化，與下游產(chǎn)物如木質(zhì)素、類黃酮等許多代謝物的合成有關(guān)。研究表明，在丹參毛狀根中過量表達(dá)SmC4H能夠顯著提高丹酚酸 B 的含量[18]，而熱脅迫導(dǎo)致SmC4H表達(dá)量下降，丹參中的迷迭香酸和丹酚酸B含量下降[15]。在大腸桿菌BL21中表達(dá) SmC4H基因，重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)效果較好，但主要以包涵體形式存在[19]。

3.3 4香豆素輔酶A連接酶基因（Sm4CL）

4香豆酸：輔酶 A 連接酶（4Coumarate：CoA ligase EC 6.2.1.12）催化肉桂酸及其衍生物產(chǎn)生相應(yīng)的CoA 酯，為植物苯丙氨酸途徑中的關(guān)鍵酶。在丹參中該酶的編碼基因Sm4CL 以基因家族形式出現(xiàn)，研究較多的是Sm4CL1 和Sm4CL2[20]。對(duì)2個(gè)Sm4CL和不同底物的親和性試驗(yàn)表明，Sm4CL1 對(duì)香豆酸親和性較高，Sm4CL2 對(duì)咖啡酸親和性較高，這也與化合物在不同細(xì)胞器及不同時(shí)間段積累有關(guān)。熱脅迫條件下Sm4CL表達(dá)量呈先上升后下降趨勢(shì)[15]。

3.4 酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因（SmTAT）

酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（tyrosine aminotransferase EC：2.6.1.5）是酪氨酸途徑上的第一個(gè)關(guān)鍵酶，可將酪氨酸轉(zhuǎn)化為 4羥基苯丙酮酸。目前已從多種植物中克隆得到TAT基因，如丹參、彩葉草、大豆、苜蓿和擬南芥[21-22]。

丹參 SmTAT 基因序列包含 6 個(gè)外顯子和 5 個(gè)內(nèi)含子，其啟動(dòng)子和終止子包含多個(gè)基因調(diào)控元件。該基因在丹參根、莖、葉中均有表達(dá)，且莖中的表達(dá)比葉和根高。熱脅迫、茉莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸和紫外照射處理分別在一定程度上上調(diào)SmTAT 轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，研究表明，丹參毛狀根中過量表達(dá)SmTAT 能夠顯著提高迷迭香酸的積累，改變迷迭香酸和丹酚酸 B 的構(gòu)成比例[18]。焦蒙麗等[23]研究了水楊酸對(duì)丹參酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的影響并探討了影響其酶活性的分子機(jī)制。

3.5 羥苯基丙酮酸還原酶基因（SmHPPR）

對(duì)羥基苯丙酮酸還原酶（hydroxyphenylpyruvate reductase.EC 1.1.1.237） 是迷迭香酸生物合成途徑中第一個(gè)使代謝流特異流向迷迭香酸的關(guān)鍵酶[24]。KIM 等[24]對(duì)彩葉草懸浮細(xì)胞中的 HPPR 蛋白進(jìn)行分離純化，并克隆得到該物種中的 HPPR 全長 cDNA 序列，異源表達(dá)得到酶蛋白，該蛋白既可催化對(duì)羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)成對(duì)羥基苯乳酸，又可催化 3，4二羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)化成3，4二羥基苯乳酸。SmHPPR在丹參根莖葉均有表達(dá)，莖中最強(qiáng)，根次之，葉表達(dá)量最少，該基因受茉莉酸、脫落酸、水楊酸及活性氧族信號(hào)的調(diào)控，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平受MeJA、SA、ABA 和赤霉素上調(diào)，UVB 和雙氧水處理能下調(diào)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平[25]，在熱脅迫處理下SmHPPR表達(dá)量前期變化不大，后期呈下降趨勢(shì)。在丹參毛狀根中，過量表達(dá)SmHPPR 及共表達(dá) SmTATSmHPPR 均能顯著提高迷迭香酸和丹酚酸 B 的含量[18]。

3.6 迷迭香酸合成酶基因（SmRAS）

迷迭香酸合成酶（rosmarinate synthase EC：2.3.1.140））首次分離于彩葉草[26]，目前研究較少，只有彩葉草、熏衣草和蜜蜂花中的迷迭香酸合成酶有報(bào)道[27-28]。迷迭香酸合成酶將 4香豆酰 CoA 與 4羥基苯乳酸共同催化生成 2氧（4香豆酰）3（4羥基苯）-乳酸，這是迷迭香酸生物合成的關(guān)鍵步驟?，F(xiàn)已從丹參中得到迷迭香酸合成酶基因，并對(duì)其表達(dá)調(diào)控和功能進(jìn)行了初步研究。SmRAS（ADA60182）編碼 428個(gè)氨基酸，其在根中表達(dá)最高，莖中次之，葉中的表達(dá)最低，SmRAS 的表達(dá)受茉莉酸甲酯的調(diào)控，茉莉酸甲酯處理10 h 其表達(dá)量達(dá)到最高，為初始表達(dá)水平的 10 倍左右，而后至 24 h下降到初始表達(dá)水平的 5 倍左右。構(gòu)建SmRAS RNAi載體，轉(zhuǎn)至丹參毛狀根中，基因的表達(dá)干涉使得丹參毛狀根中的酚酸類成分積累受到明顯影響，下降最明顯的I5株系的迷迭香酸和丹酚酸B分別為對(duì)照的20%和30%，初步闡述了該基因在丹參酚酸類成分合成中的作用[9]。

RAS是一個(gè)多基因家族，目前只研究了一條SmRAS，2013年9月NCBI上公布了5條新的SmRAS家族成員，目前已全部克隆得到。對(duì)比6條SmRAS基因編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，它們?cè)赗AS特有的肽段DEDYL上有很大差異，SmRAS2、SmRAS3、SmRAS4和SmRAS6在該處的氨基酸是NDEL，SmRAS1在該處的氨基酸是DEDYL，而SmRAS5的是KDEYL[29]，因此，到底哪一條SmRAS4在丹參迷迭香酸的生物合成中貢獻(xiàn)最大，SmRAS的關(guān)鍵催化活性位點(diǎn)還有待于進(jìn)一步深入研究。

3.7 細(xì)胞色素P450酶基因（SmCYP98A14）

CYP98A14（coumaroyl 3′monooxygenase EC：1.14.13.36）是細(xì)胞色素 P450 酶，在迷迭香酸合成過程中將 SmRAS 催化 4香豆酰 CoA 與 4羥基苯乳酸生成的 2氧（4香豆酰）3（4羥基苯）乳酸在 3 位和 3位添加羥基從而生成迷迭香酸。

目前已經(jīng)從彩葉草中分離得到 CYP98A14 基因并驗(yàn)證了功能[30]。邸鵬[9]克隆了SmCYP98A14，對(duì)其組織表達(dá)特異性和表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了研究，通過該基因的干涉和過表達(dá)初步研究了其在植物體內(nèi)的功能。SmCYP98A14（HQ316179）開放閱讀框（ORF）包含1 527 bp ，編碼 508 個(gè)氨基酸。其在根中表達(dá)量最高，葉中次之，莖中極低。用脫落酸和茉莉酸甲酯處理丹參，發(fā)現(xiàn)SmCYP98A14的表達(dá)受 ABA 影響非常顯著，在 2 h 時(shí)表達(dá)相對(duì)于空白提升了 40 倍，隨后在 4 h下降到初始水平左右。同時(shí)SmCYP98A14受茉莉酸甲酯調(diào)控，2 h表達(dá)達(dá)到最大值，為對(duì)照的15 倍左右，從4 h 開始逐漸下降，于 12 h 降至初始水平，而后又有小幅上升。通過反義干擾和RNAi技術(shù)抑制 SmCYP98A14 的表達(dá)對(duì)丹參中酚酸類成分積累有明顯的影響[9]。

3.8 NADH細(xì)胞色素P450還原酶酶基因（SmCPR）

SmCPR 是一類 NADPH細(xì)胞色素 P450 還原酶，它能夠提高 SmCYP98A14 對(duì)底物的催化效率。SmCPR（FR693803）開放閱讀框（ORF）2 118 bp，編碼 705個(gè)氨基酸，其在根莖葉的表達(dá)較接近。 SmCPR 基因的表達(dá)受 ABA 影響，在 2 h 時(shí)表達(dá)相對(duì)對(duì)照提高 8倍，隨后均在 4 h 下降到初始水平左右。SmCPR的表達(dá)受甲基茉莉酸調(diào)控，處理 2 h表達(dá)達(dá)到最大值（為初始表達(dá)的 20 倍左右），4 h 后逐漸下降，在 12 h 時(shí)降至初始水平，而后又有小幅上升[9]。

4 研究展望

為了提高品質(zhì)、滿足市場(chǎng)需求，利用基因工程、細(xì)胞工程等現(xiàn)代生物技術(shù)手段對(duì)丹參進(jìn)行改良以提高其藥材有效成分的含量愈來愈受到人們的重視，許多基于毛狀根培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)的方法被用于提高丹參中水溶性酚酸類物質(zhì)的含量。目前，丹參功能基因組研究已經(jīng)全面展開，丹參次生代謝骨架途徑已經(jīng)基本明了，隨著分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，利用整合分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等研究技術(shù)與手段，揭示代謝網(wǎng)絡(luò)中能量利用和代謝流分配的規(guī)律，闡明丹參重要活性成分生物合成調(diào)控機(jī)制，使人們對(duì)丹參酚酸類成分的研究與認(rèn)識(shí)越來越深入，并使得利用關(guān)鍵酶基因在模式微生物中進(jìn)行異源表達(dá)來生產(chǎn)丹酚酸類成分成為可能。這將有效地解決丹參植物資源短缺的問題，并對(duì)于進(jìn)一步高效開發(fā)利用丹參資源具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]

中華人民共和國藥典委員會(huì).中國藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：53.

[2] 杜冠華，張均田.丹參水溶性有效成分——丹酚酸研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2000，20（5）：394398.

[3] 黃詒森，張均田.丹參中三種水溶性成分的體外抗氧化作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992，27（2）：96-100.

[4] 劉鷹翔，計(jì)志忠.迷迭香酸藥理作用的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)藥·植物藥分冊(cè)，1993，8（6）：248-251.

[5] SNABONGI C，TKAANO H，OSAKABE N，et al.Rosmarinic acid inhibits lung injury induced by diesel exthaust particles[J].Free Radic Boil Med，2003，34：1060-1069.

[6] PETERSEN M，HAUSLER E，KARWATZKI B，et al.Proposed biosynthetic pathway for rosmarinic acid in cell cultures of Coleus blumei Benth[J].Planta，1993，189：10-14.

[7] PETERSEN M，ABDULLAH Y，BENNER J，et al.Evolution of rosmarinic acid biosynthesis[J].Phytochemistry，2009，70：1663-1679.

[8] ZHANG S C，YAN Y，WANG B Q，et al.Selective responses of enzymes in the two parallel pathways of rosmarinic acid biosynthetic pathway to elicitors in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2014，117（5）：645-651.

[9] 邸鵬.丹參酚酸類成分生源途徑的探索及相關(guān)基因的克隆與功能研究[D].上海：上海第二軍醫(yī)大學(xué)，2012.

[10] DI P，ZHANG L，CHEN J，et al.13C Tracer Reveals Phenolic Acids Biosynthesis in Hairy Root Cultures of Salvia miltiorrhiza[J].ACS Chemistry Biology，2013，8：1537-1548.

[11] HU Y S，ZHANG L DI P，et al.Cloning and induction of phenylalanine ammonialyase gene from salvia miltiorrhiza and its effect on hydrophilic phenolic acids levels[J].Chinese Journal of Natural Medicines，2009，7（6）：449-457.

[12] SONG J，WANG Z Z.RNAimediated suppression of the phenylalanine ammonialyase gene in Salvia miltiorrhiza causes abnormal phenotypes and a reduction in rosmarinic acid biosynthesis[J].Journal of Plant Research，2011，124（1）：183-192.

[13] 行冰玉，黨小琳，張婧一，等.茉莉酸甲酯對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中迷迭香酸生物合成及相關(guān)酶活性的影響[J].植物生理學(xué)報(bào)，2013，49（12）：1326-1332.

[14] 劉連成，董娟娥，張婧一，等.Ca2+對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中迷迭香酸合成及其相關(guān)酶活性的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（11）：1359-1369.

[15] 李東.吳先軍，陳新.熱脅迫下丹參迷迭香酸代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，26（1）：60-67.

[16] 陳紅艷，劉連成，董娟娥，等.H2O2參與水楊酸誘導(dǎo)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸 B 合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（7）：834-846.

[17] HUANG B，DUAN Y，YI B，et al.Characterization and expression profiling of cinnamate 4hydroxylase gene from Salvia miltiorrhiza in rosmarinic acid biosynthesis pathway[J].Russian Journal of Plant Physiology，2008，55（3）：390-399.

[18] XIAO Y，GAO S，DI P，et al.The c4h，tat，hppr and hppd Genes Prompted Engineering of Rosmarinic Acid Biosynthetic Pathway in Salvia miltiorrhiza Hairy Root Cultures[J].Plos One，2011，6（12）：29713.

[19] 張婷婷，王春麗，韓蕊蓮，等.丹參C4H基因pET32a原核表達(dá)載體的構(gòu)建[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，39（7）：158-162.

[20] ZHAO S J，HU Z B，LIU D，et al.Two Divergent Members of 4‐Coumarate：Coenzyme A Ligase from Salvia miltiorrhiza Bunge：cDNA Cloning and Functional Study[J].Journal of Integrative Plant Biology，2006，8（11）：1355-1364.

[21] NAKAMURA Y，SATO S，KANEKO T，et al.Structural analysis of Arabidopsis thaliana chromosome 5.III.Sequence features of the regions of 1，191，918 bp covered by seventeen physically assigned P1 clones[J].DNA Research，1997，4（6）：401-414.

[22] GROSSMESILATY S，HARGROVE J L，CIECHANOVER A.Degradation of tyrosine aminotransferase （TAT） via the ubiquitin-proteasome pathway[J].FEBS Letters，1997，405（2）：175-180.

[23] 焦蒙麗，曹蓉蓉，陳紅艷，等.水楊酸對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中迷迭香酸生物合成及其相關(guān)酶的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（3）：320-328.

[24] KIM K H，JANIAK V，PETERSEN M.Purification，cloning and functional expression of hydroxyphenylpyruvate reductase involved in rosmarinic acid biosynthesis in cell cultures of Coleus blumei[J].Plant Molecular Biology，2004，54（3）：311-323.