謝麗

摘要 紫外可見分光光度計是對物質進行定量、定性、結構分析以及反應動力學等研究的常用儀器，被廣泛應用于化學、醫(yī)學、藥學、生命科學和環(huán)境科學等多個領域。該文簡單解析了日立U-3900H型紫外可見分光光度計各功能模塊參數(shù)設置的方法。

關鍵詞 紫外可見分光光度計；功能模塊；參數(shù)設置

中圖分類號 S237 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）26-09261-04

Analysis on Utilization of Function Modules of U-3900H UV Visible Spectrophotometer

XIE Li （School of Life Sciences， Lanzhou University， Lanzhou， Gansu 730000）

Abstract UV visible spectrophotometer is a common instrument used in quantitative and qualitative analysis， structure analysis and reaction kinetic study. It has been widely applied to each field of chemistry， medicine， pharmaceutical analysis， life science and environmental science etc. This paper introduces the parameters setting of function modules of Hitachi U-3900H UV visible spectrophotometer.

Key words UV visible spectrophotometer； Function modules； Parameters setting

自1918年第一臺紫外可見分光光度計問世以來，在物理學、化學、生物學、醫(yī)學、材料學、環(huán)境科學、石油化工、藥學、農業(yè)、軍工等研究、生產和管理部門，已經有廣泛的應用^[1-2]。隨著分光元件及技術、檢測器件及技術、大規(guī)模集成制造技術等的發(fā)展，以及微處理器、單片機和計算機技術廣泛應用于分析儀器，使紫外可見分光光度計的性能指標不斷提高，并且出現(xiàn)了自動記錄、自動打印、數(shù)字顯示、微機控制等使用上方便快捷的儀器產品^[1-3]。

蘭州大學生命科學學院生命科學研究實驗中心購置的U-3900H型紫外可見分光光度計是日立高新公司研制的一款雙光柵雙光束紫外可見分光光度計，其分析對象可從固體材料到液體材料，具有很強的適應性。該機開機即啟動對ROM、RAM、波長啟動裝置和點亮鎢燈、點亮氘燈、狹縫裝置和斬波器的自動檢測；自帶的UV Solutions程序不僅可以輕松控制儀器精密的機械系統(tǒng)，而且提供了多元化的信號與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；實現(xiàn)了自動切換光源以及波長、掃描速度、狹縫的選擇等多項操作，分析功能強大。U-3900H型分光光度計在使用上被劃分為4個功能模塊——波長掃描、時間掃描、光度測量和核酸測量。使用時各參數(shù)的設置很有條理性，對開展生命科學的研究發(fā)揮了重要的作用。下面就該機使用時如何對這4個功能模塊設置參數(shù)進行解析。

1 U-3900H型紫外可見分光光度計的光路

U-3900H型紫外可見分光光度計的光路如圖1所示。他使用的光源由光源WI（鎢燈）和D2（氘燈）所發(fā)出的，光經反射聚光鏡M1反射進入第一個單色器集團C1。進入C1的光經濾光器F、狹縫S1，進入環(huán)形衍射光柵M2。從M2出來的光通過狹縫S2進入第2單色器集團C2。進入C2的光射入變槳距像差校正衍射光柵M3，從M3出來的光通過狹縫S3，從而完成了將復合光分解成單色光并可從中選出一任意波長的單色光，不同波長的單色光束連續(xù)依次射出單色器集團中的色散元件，從而實現(xiàn)波長掃描^[4]。由S3出來的單色光經平光鏡M4、旋轉鏡M5、超環(huán)面反射鏡M6進入放對照品的樣品池1。由旋轉鏡M5出來的一束光經超環(huán)面反射鏡M6、平面鏡M7進入放樣品的樣品池2。從樣品池1出來的參考光束經超環(huán)面反射鏡M8、平面鏡M9進入檢測器PMT（光電倍增管），這時產生參照測量信號R。從樣品池2出來的光束經超環(huán)面反射鏡M10、平面鏡M11進入檢測器PMT，這時產生樣品測試信號S。

需要說明的是U-3900H分光光度計采用Seya-Namioka單色儀，安裝了像差校正凹面光柵。同時擁有光束的聚焦和色散功能，光學系統(tǒng)性能強，采用了更少的反射鏡而只需更短的光路，因此消像差能力及光學明亮度都得到了很大提高。

2 功能模塊解析

2.1 波長掃描模塊

波長掃描模塊的功能是在一定的波長范圍內，對樣品進行測量，反應出樣品在不同波長下的%T（光透過率）、Abs（吸光度值）、E（S）（樣品光束的能量）、E（R）（參照品光束的能量）和%R（光的反射率）。

2.1.1 預設程序。檢測樣品之前需打開軟件，在波長掃描的功能模塊預設程序，進行參數(shù)的選擇與設置。點擊軟件界面右側快捷欄的“Method”后，立即顯示分析方法（Analysis Method）的5個重疊界面，分別為General（常規(guī)）、Instrument（儀器條件）、Monitor（模擬監(jiān)視）、Processing（處理方法）、Report（報告格式）。

在“Method-General”界面選擇“Wavelength scan”模式。Instrument項會自動給出儀器型號；填寫所用附件、測試人員、試驗內容、試驗樣品名稱等信息；Load可調入已經存在的條件；Save保存當前設定的信息或Save As將當前的信息另存為。參見圖2。

在“Method-Instrument”界面，從%T、Abs、E（S）、E（R）、%R中選擇測量的數(shù)據(jù)模式；設定波長掃描的范圍（190～1 100 nm）；設定掃描速度可以有1.5、3.0、15.0、30.0、60.0、120.0、300.0、600.0、1 200.0、1 800.0和2 400.0 nm/min 11種選擇；當樣品具有陡峭的光譜數(shù)據(jù)時，可啟動高分辨率模式；設置基線校正時，要選擇用戶基線校正，而非系統(tǒng)基線校正；設置執(zhí)行測樣前需要延緩的時間，這樣可以讓環(huán)境溫度在測量時達到穩(wěn)定狀態(tài)，不會對測量結果產生較大的影響；設置光源是WI還是D2或者是兩者均需要；設定狹縫寬度可以有0.1、0.5、1.0、2.0、4.0和5.0 nm 6種選擇；設置PMT模式時，若常規(guī)測量，選擇自動模式，若要測量能量，則需選擇固定模式。當選擇了固定模式后，可對PMT的電壓進行設定，設定范圍為0～1 000 V；對數(shù)據(jù)采集間隔進行設置可以有0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.100 00、0.200 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0、5.00 0 nm 9種選擇；設定樣品的測量次數(shù)（1～99次）。對光通過測量樣品路徑可以進行校正，當比色皿不是標準的10 mm時，通過該設置可以校正到10 mm的標準測量值（圖3）。

在“Method-Monitor”界面設置Monitor window的參數(shù)，設定縱坐標的數(shù)值范圍；設定每次數(shù)據(jù)采集完之后的譜圖是否疊加顯示；設定數(shù)據(jù)采集完后是否打開數(shù)據(jù)處理窗口；設定數(shù)據(jù)采集后是否啟動自動打印（圖4）。

在“Method-Processing”界面設置數(shù)據(jù)處理方式，數(shù)據(jù)處理方式有Savitsky-Golay Smooth（Savitsky-Golay 平滑）、Mean Smooth（平均平滑）、Median Smooth（中間平滑）、Derivative（微分求導）4種；設置什么樣的數(shù)據(jù)處理方式是根據(jù)測試者需要檢出的峰（Peak Finding），可以對峰的檢出方法（Integration）、峰的閾值（Threshold）和靈敏度（Sensitivity）進行設置。其中Integration包括Rectangular（矩形）、Trapezoid（斜方形）和Romberg（龍伯格）3種；Threshold可決定信號峰的取舍，賦值范圍為0.001-1000；Sensitivity可改變放大器的放大倍數(shù)，一般設置為1（圖3）。

在“Method-Report”界面設置輸出report的數(shù)據(jù)項，可選擇microsoft excel格式保存輸出、完成后直接打印或利用變換器（需增加儀器附件）打印圖表；打印或保存的項目有data、method、graph、data listing、peak table、peak WL/peak data、start WL/End WL、valley WL/valley data、peak area（圖6）。

2.1.2 基線校正。在平行的參照池和樣品池中均放入空白樣品，點擊“baseline”鍵，進行基線校正，等出現(xiàn)綠色ready后，點擊“measure”鍵后，會出現(xiàn)校正后的基線。

2.1.3 樣品測試。把樣品室池中的空白樣品換成測試樣品，點擊“sample”鍵，在跳出來的sample對話框對樣品的名稱（40個字符以內）、內容（255個字符以內）、自動保存格式及保存地點進行設置。設置好之后，點擊“measure”鍵，進行樣品的波長掃描測試。

2.2 時間掃描模塊 時間掃描模塊的功能是指在一定的波長條件下，一段時間內，測試樣品的Abs、%T、E（S）、E（R）和%R隨時間變化的情況。

2.2.1 預設程序。

檢測樣品之前需打開軟件，在時間掃描的功能模塊預設程序，進行參數(shù)的選擇與設置。點擊軟件界面右側快捷欄的“Method”后，立即顯示分析方法（Analysis Method）的5個重疊界面，分別為General（常規(guī)）、Instrument（儀器條件）、Monitor（模擬監(jiān)視）、Processing（處理方法）和Report（報告格式）。

在軟件的“Method-General”界面選擇“Time scan”模式，該界面的其他參數(shù)選擇與設置同波長掃描模塊相同。

在軟件的“Method-Instrument”界面，從%T、Abs、E（S）、E（R）、%R中選擇測量的數(shù)據(jù)模式；設定波長（190～1 100 nm）；設置測試時間（60～99 990 s）；選擇在每一次測試樣品之前進行自動歸零。此外，其他參數(shù)的設置和選擇與波長掃描模塊相同。

在“Method-Monitor”界面設置Monitor window的參數(shù)，設定橫坐標和縱坐標的數(shù)值范圍（橫坐標為時間t）；設定每次數(shù)據(jù)采集后的譜圖是否疊加顯示；設定數(shù)據(jù)采集后是否打開數(shù)據(jù)處理窗口；設定數(shù)據(jù)采集后是否自動打印。

在“Method-Processing”界面設置數(shù)據(jù)處理方式、檢出峰的參數(shù)，均與波長掃描模塊相同。與波長掃描不同的是可對動力學研究中的起始、終止時間以及動力學因子進行設置。

在“Method-Report”界面設置輸出report的數(shù)據(jù)項，數(shù)據(jù)輸出項的設置與波長掃描模式中的基本相同，只是多了一項kinetics。

2.2.2 樣品測試。放入待測樣品和參比液，點擊“sample”鍵，在跳出來的sample對話框中對樣品的名稱、內容、自動保存格式及保存地點進行設置。設置好之后，點擊“autozero”鍵，進行樣品測試前的自動歸零。點擊“measure”鍵，進行樣品的時間掃描測試。

2.3 光度測量模塊

光度測量模塊的功能是通過建立標準曲線來測定未知樣品的濃度。

2.3.1 預設程序。 操作之前需要打開軟件，選擇或設置相關參數(shù)。點擊軟件界面右側快捷欄的“Method”后，立即顯示分析方法（Analysis Method）的7個重疊界面，分別為General（常規(guī)）、Quantitation（定量分析）、Instrument（儀器條件）、Standards（標準品）、Monitor（模擬監(jiān)視）、Processing（處理方法）、Report（報告格式）。

在軟件的“Method-General”界面選擇“Photometry”模式，該界面的其他參數(shù)選擇與設置同波長掃描模塊相同。

在軟件的“Method-Quantitation”中，測量類型可從波長、峰面積、峰高、微分求導和比例中選擇。如果選擇了波長，只有設置了標準曲線的類型、波長數(shù)目、濃度單位和濃度的有效數(shù)字（10n，設置n的值），才能相應獲取一級校準曲線、2級校準曲線、3級校準曲線和SEGMENT校準曲線等4種類型的校準曲線和樣品的相關數(shù)據(jù)。如果選擇了峰面積、峰高，并設定了指定波長，峰的檢出方法從rectangular、trapezoid和romberg中進行選擇，設置濃度單位和濃度的有效數(shù)字，才能獲得標準曲線和樣品的濃度。如果選擇了微分求導為測量類型，需要設置波長、標準曲線的類型、濃度單位、濃度的有效數(shù)字以及微分求導方法，才能獲得標準曲線和樣品濃度。如果選擇了比例為測量類型，需要設置K-factor0、K-factor1、K-factor2因子以及計算方法（減法、加法或乘法），然而此種測量類型將不能獲得標準曲線。

在“Method-Instrument”界面，如果選擇了波長和比例為測量類型，那么需要設置波長、光源、狹縫寬度、PMT模式和范圍，以及校正光通過測量樣品路徑。這些參數(shù)的設定與波長掃描模塊相同。如果選擇了峰面積、峰高、微分求導為測量類型，那么僅設定Abs為數(shù)據(jù)模式，需要設置波長范圍、掃描速度、分辨率模式、基線校正、光源、狹縫寬度、PMT模式和范圍、樣品的測量次數(shù)，以及校正光通過測量樣品路徑等，這些參數(shù)的設定與波長掃描模塊相同。

在“Method-Standars”界面，設置標準品的序號、名稱、內容、濃度等。

在“Method-Monitor”界面設置Monitor window的參數(shù)，方式及意義同波長掃描模塊。

在“method-report”對話框中選擇輸出report的數(shù)據(jù)項，參數(shù)設置與波長掃描模塊類似。

2.3.2 自動歸零或基線校正。

如果選擇波長或比例為測量類型，那么在“Method-Instrument”界面選擇在每次側樣之前進行自動歸零；如果選擇了峰高、峰面積或微分求導為測量類型，那么在測樣之前需要執(zhí)行基線校正。

2.3.3 標準品和樣品的測量。

放入標準品/樣品和參比液，點擊“sample”鍵，在跳出來的sample對話框中對標準品/樣品的名稱、內容、自動保存格式及保存地點進行設置。設置好之后，點擊“measure”鍵，進行標準品和樣品的測量；按照“Method-Standars”中設定的標準品順序，依次測量標準品，標準品測量完成后，會跳出一個對話框，選擇開始測量未知樣品，進行未知樣品的測量。

2.4 核酸測量模塊 核酸測量模塊的功能是通過測量特定波長處的吸光度值來計算各種核酸（RNA、ssDNA、dsDNA、labeled DNA）樣品的純度、比例、濃度、摩爾濃度及蛋白質濃度等。

2.4.1 預設程序。

操作之前需要打開軟件，選擇或設置相關參數(shù)。點擊軟件界面右側快捷欄的“Method”后，立即顯示分析方法（Analysis Method）的7個重疊界面，分別為General（常規(guī)）、Instrument（儀器條件）、Monitor（模擬監(jiān)視）、Processing（處理方法）、Nuleic acid parameter（核酸參數(shù)）、Base sequence parameter（堿基序列參數(shù)）、 Report（報告格式）。

在軟件的“Method-General”界面選擇“Nucleic Acid Measurement”模式，該界面的其他參數(shù)選擇和設置與波長掃描模塊相同。

在軟件的“Method-Instrument”界面，測量的數(shù)據(jù)模式通常只選擇Abs；如果未專門做背景校正，那么波長的范圍設定在230 nm<λ<280 nm，如果選擇了320 nm<λ<350 nm范圍內的任意波長λ₁處的Abs做了背景校正，那么波長的范圍設定在230nm<λ<λ₁。該界面的其他參數(shù)設置與波長掃描模式中的相同。

在“Method-Monitor”界面設置Monitor window的參數(shù)，與波長掃描模塊相同。

在“Method-Processing”界面設置數(shù)據(jù)處理方式，與波長掃描模塊相同。

在“Method-Nuleic acid parameter”界面，測量數(shù)據(jù)的模式選擇了RNA、ssDNA、dsDNA中的一個；選擇并設置背景校正參數(shù)；設置濃度計算時的濃度因子、濃度單位、濃度的有效數(shù)字；在測量核酸樣品的純度、比例、濃度、摩爾濃度及蛋白質濃度等時，需要設置兩個測量波長（260和280 nm）；若結果中顯示測量比例的結果，那么選擇測量比例項，還可對純度的上下限進行設置，或指定純度值；設定系數(shù)K₀、K₁、K₂通過Warburg-Christian方法自動計算出蛋白質的濃度。若選擇了labeled DNA作為測量數(shù)據(jù)的模式，那么在測量波長處需要設定消光系數(shù)e₁，在色素標記波長處需要設定DNA的消光系數(shù)e₂，在測量波長處設定色素的消光系數(shù)e₃，輸入色素標記物的波長、測量波長，設置濃度單位和濃度的有效數(shù)字。

在“Method-Base sequence parameter”界面，輸入A、C、G和T各種堿基的數(shù)目，輸入、上傳或粘貼堿基序列（不超過1 056 bp）。

在“Method-Report”界面設置輸出report的數(shù)據(jù)項，參數(shù)設置與波長掃描模塊相同。

2.4.2 基線校正。參數(shù)設置和操作與波長掃描相同。

2.4.3 樣品測量。參數(shù)設置和操作也與波長掃描相同。

3 結語

紫外可見分光光度計不僅使用歷史悠久，而且在多個研究與應用領域具有不可替代的作用。隨著現(xiàn)代科技與生產的不斷發(fā)展與進步，紫外可見分光光度計的性能指標不斷被提高，其功能在使用上也越來越便捷。U-3900H型紫外可見分光光度計就是一款不僅性能指標優(yōu)良，而且具有非常清晰明確的4個功能模塊，在使用上非常方便。為了發(fā)揮該款儀器的使用效率，應該首先掌握其4個功能模塊的參數(shù)設置。

參考文獻

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