尹紅力 佟麗麗 王振宇 李婷婷 劉冉

摘要 前期研究發(fā)現(xiàn)，硫酸酯化黑木耳酸性多糖具有較好的生物活性，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)黑木耳酸性多糖的最佳硫酸酯化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究。研究了氯磺酸與N，N-二甲基甲酰胺的體積比、酯化試劑的體積含量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、轉(zhuǎn)速5個(gè)因素對(duì)黑木耳多糖硫酸酯化取代度的影響。利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近因素的最大響應(yīng)區(qū)域，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)法對(duì)各因素的水平組合進(jìn)行優(yōu)化，獲得黑木耳酸性多糖硫酸酯化優(yōu)化條件：氯磺酸∶N，N-二甲基甲酰胺為1∶3.49、酯化試劑比例為33%、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間112.84 min、轉(zhuǎn)速為200 r/min，在此優(yōu)化條件下硫酸酯化黑木耳酸性多糖的取代度可達(dá)0.490 5。

關(guān)鍵詞 黑木耳酸性多糖；硫酸酯化；響應(yīng)面法；工藝條件優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào) S646.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）26-09167-05

Study on the Optimization of Acid Auricularia Auricular Polysaccharides Sulfate Esterification Process by Response Surface Methodology

YIN Hong-li et al （Department of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract Previous studies have found that sulfate esterification Auricularia auricular acidic polysaccharides has good biological activity. Response surface methodology was adopted to optimize sulfuric acid esterification process conditions for Auricularia auricular polysaccharides. Effects of the volume ratio of chlorosulfonic acid and N， N- dimethyl formamide， the volume ratio of esterification reagent， the reaction temperature， the reaction time， rotational speed on degree of substitution of the ulfatex acid esterification for polysaccharide of Auricularia auricular were studied. The path of steepest ascent was used to define optimal response region for these three factors. Optimal level combinations of factors were obtained through Box-Behnken design. The optimal sulfuric acid esterification process conditions for polysaccharide of Auricularia auricular were as follows： the volume ratio of chlorosulfonic acid and N， N dimethyl formamide is 1∶3.49， the volume ratio of the esterification reagent is 33%， the reaction temperature is 50 ℃， the reaction time is 112.84 min， rotational speed is 200 r/min. Under optimal sulfuric acid esterification conditions， the DS of polysaccharide reached 0.490 5.

Key words Auricularia auricular acidic polysaccharides； Sulfuric acid esterification； Response surface methodology； Process conditions optimization

多糖（polysaccharide，簡(jiǎn)稱PS）是一類(lèi)具有廣泛生物活性的生物大分子物質(zhì)，目前已有300多種多糖類(lèi)化合物從天然產(chǎn)物中被分離^[1]。研究表明，黑木耳多糖具有許多重要的生理功能，如降血糖^[2-3]、降血脂^[4-5]、抗腫瘤^[6-7]、抗衰老^[8]、提高機(jī)體免疫等功能。硫酸酯化多糖 （Sulfated Polysacchides）除已證實(shí)具有抗凝血^[9]作用外，近年來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)它有多種生物活性，如抗病毒的活性^[10]、提高多糖的免疫調(diào)節(jié)活性^[11-12]、抗氧化能力^[13]、抗腫瘤^[14]活性。目前研究了黑木耳多糖硫酸酯化在藥用價(jià)值、分離純化等方面的應(yīng)用^[15]，而對(duì)黑木耳酸性多糖的硫酸酯化制備工藝以及生理活性作用方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn)，硫酸酯化黑木耳酸性多糖具有更好的生物活性，為了增強(qiáng)其功能性質(zhì)，筆者對(duì)黑木耳酸性多糖硫酸酯化修飾進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)。

多糖硫酸酯的抗病毒活性、降血糖活性等與分子量、硫酸基取代度、糖苷鍵結(jié)構(gòu)、給藥途徑等有關(guān)^[16]，其中取代度是主要的影響因素，因?yàn)榱蛩峄囊肟梢愿淖兌嗵堑牧Ⅲw構(gòu)象，而構(gòu)象的改變往往是生物活性變化的決定因素。因此，筆者以取代度為相關(guān)因素進(jìn)行評(píng)估，通過(guò)該研究獲得高取代度的硫酸酯化黑木耳酸性多糖，從而為黑木耳資源的開(kāi)發(fā)利用，以及開(kāi)發(fā)新品種的保健因子、保健食品或藥品等應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試原料：黑木耳，黑龍江省海林市北味黑木耳。主要試劑：氯磺酸、N，N-二甲基甲酰胺、無(wú)水甲酰胺、乙醇、明膠（生化試劑），上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站；氯化鋇、濃鹽酸、無(wú)水硫酸鈉、三氯乙酸和氫氧化鈉均為分析純。

主要儀器：RE52-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、JB50-D型增力電動(dòng)攪拌器、Spectru mlab53紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、EMS-8A加熱磁力攪拌器，天津歐諾儀器儀表有限公司；ALC-110.4電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDA-8002水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；756PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FD-18真空冷凍干燥機(jī)，上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；BSZ-100自動(dòng)部分收集器，上海瀘西分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑木耳酸性多糖的制備。

原料預(yù)處理→0.1 mol/L NaCl熱水浴浸提（料液比1∶50 g/ml、提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間4 h）→離心（4 000 r/min，10 min）→上清液抽濾→用1 mol/L HCl調(diào)pH至7.0→濃縮→3%H₂O₂脫色→Sevage法除蛋白（氯仿∶正丁醇=4∶1；Savage試劑∶多糖溶液=1∶4）→醇沉24 h→離心→復(fù)溶→透析→凍干→多糖粗品。

多糖粗品過(guò)纖維素DEAE-52柱，分別用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L NaCl洗脫，收集0.2 mol/L NaCl洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，透析，凍干后得到黑木耳酸性多糖。

1.2.2 磺酸化試劑制備。

準(zhǔn)確量取一定體積N，N-二甲基甲酰胺置于附有冷凝裝置的三頸瓶中，然后將三頸瓶置于冰水浴中，并用鐵架臺(tái)固定，于磁力攪拌器上攪拌。用膠頭滴管以緩慢的速度將氯磺酸滴入N，N-二甲基甲酰胺中，制備得到氯磺酸∶N，N-二甲基甲酰胺的磺酸化試劑，整個(gè)過(guò)程持續(xù)2～3 h。

1.2.3 黑木耳酸性多糖硫酸酯化的制備。

稱取一定真空冷凍干燥的黑木耳酸性多糖，溶于無(wú)水甲酰胺中，加入一定量的磺酸化試劑，在一定溫度及轉(zhuǎn)速條件下振蕩一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻至室溫，加入3倍體積95%乙醇進(jìn)行醇沉24 h。離心后取沉淀，用60%乙醇洗滌3次，將沉淀溶于50 ml蒸餾水中，攪拌后用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，然后流水透析（3 500 Da）48 h，蒸餾水透析24 h。真空濃縮，醇沉，冷凍干燥得硫酸酯化黑木耳酸性多糖。得率計(jì)算公式如下：

1.2.4 取代度測(cè)定（DS）。

氯化鋇-明膠濁度法：取0、0.04、0.08、0.12、0.16和0.20 ml硫酸鈉于具塞試管中，補(bǔ)加1 mol/L HCl至0.20 ml，分別加入3.8 ml 3%三氯乙酸（W/V）和1.0 ml氯化鋇-明膠混勻后靜置15 min。

以不含標(biāo)液的0號(hào)管為空白，測(cè)360 nm吸光值，得硫含量與吸光度值之間的線性關(guān)系為：y=0.002 7x+0.005 2，其中相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2符合要求。表明硫含量在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系，符合朗伯比爾定律。

稱取硫酸酯化衍生物4.5 mg于具塞試管中，加4.5 ml 1 mol/L HCl，100 ℃下水解2.5 h，冷卻至室溫后取0.2 ml進(jìn)行測(cè)定，后續(xù)同標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品取代度的計(jì)算：

DS=1.62×S%/（32-1.02×S%）

式中，DS 表示取代度；S%為樣品中硫的含量^[17]。

1.2.5 取代度的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，以硫酸酯化多糖取代度作為考察指標(biāo)，對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行評(píng)估，篩選出具有顯著效應(yīng)的幾個(gè)因素。根據(jù)其試驗(yàn)結(jié)果，在此基礎(chǔ)上，利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近以上3個(gè)因素的最大響應(yīng)區(qū)域。采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇對(duì)多糖取代度影響大的幾個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素條件的確定

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)硫酸酯化黑木耳酸性多糖取代度的影響。

從圖1中可看出，黑木耳酸性多糖硫酸酯化中硫酸基取代度隨酯化溫度的升高呈先增大后減少的變化趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)溫度升高超過(guò)50 ℃，DS開(kāi)始下降，表明升高溫度有利于硫酸酯化反應(yīng)的充分進(jìn)行，但溫度升高超過(guò)一定程度后，在高溫環(huán)境下副反應(yīng)占主導(dǎo)地位。由此得出，最佳反應(yīng)溫度為50 ℃。

Plackeet-Burman主效應(yīng)分析表中，Pr>|t|值表示其對(duì)應(yīng)因素的顯著性，在95%的水平上，Pr>|t|值<0.05表示顯著。T檢驗(yàn)值的大小顯示出因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的大小。通過(guò)Plackeet-Burman因素水平及主效應(yīng)分析，選取影響顯著的3個(gè)因素作為最陡爬坡試驗(yàn)的研究對(duì)象。

由表3可知，在試驗(yàn)因素對(duì)硫酸酯化多糖取代度影響的試驗(yàn)中， D對(duì)硫酸酯化多糖取代度產(chǎn)生正效應(yīng)，A對(duì)硫酸酯化多糖取代度產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。因素A、D的影響顯著，C次之，由于這幾個(gè)因素對(duì)取代度影響顯著，選擇其作為后續(xù)研究的因素。綜合以上分析，選取因素A、C、D作為最陡爬坡試驗(yàn)的研究因素。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Steepest ascent design）及結(jié)果

根據(jù)“2.2”的Plackett-Burman試驗(yàn)分析的結(jié)果，綜合因素的正負(fù)效應(yīng)確定其變化的方向，并縮小步長(zhǎng)，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，具體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)優(yōu)化后確定的硫酸酯化黑木耳酸性多糖的最優(yōu)制備條件為： 反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間112.84 min、酯化試劑比例為33%、氯磺酸∶N，N-二甲基甲酰胺為1∶3.49、轉(zhuǎn)速為200 r/min。在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得取代度為0.490 5，這與理論值誤差較小。所以，利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到硫酸酯化黑木耳酸性多糖的制備條件真實(shí)可靠，能夠?yàn)楹谀径嵝远嗵橇蛩狨セ苌镌诒＝∫蜃?、功能性食品或藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，在實(shí)踐中具有指導(dǎo)意義。

目前研究了硫酸酯化黑木耳多糖在藥用價(jià)值、分離純化等方面的應(yīng)用，而對(duì)黑木耳酸性多糖的硫酸酯化制備工藝以及生理活性作用方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。該研究為黑木耳資源的開(kāi)發(fā)利用，以及開(kāi)發(fā)新品種的保健因子、保健食品或藥品等應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]王彥軍.中藥多糖研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2009，22（3）：360-362.

[2] 宗燦華，于國(guó)萍.黑木耳多糖對(duì)糖尿病小鼠降血糖作用[J].食用菌，2007，29（4）：60-61.

[3] 韓春然，馬永強(qiáng)，唐娟.黑木耳多糖的提取及降血糖作用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25（5）：111-114.

[4] 王獻(xiàn)友，陳培云，吳廣臣，等.黑木耳多糖提取及其藥理活性的研究進(jìn)展[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，43（5）：683-687.

[5] 孫暢，姜明，段旭彤，等.黑木耳的保健和藥用價(jià)值以及開(kāi)發(fā)前景分析[J].科技視界，2012，5（1）：17-18.

[6] MISAKI A，KAKUTA M.Studies on interrelation of structure and anti tumor effeets of polysaccharides： antitumor action of periodatemodifled branched（1-3）-β-D-glucan of Auricularia Auricula-judae，and polysaccharides confaining（l-3）.glyeosidielinkages[J].CarbohydrateReseareh，1981，92：115-120.

[7] 左江成，高寶安，曾一芹，等.黑木耳多糖對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞周期和凋亡的影響[J].中成藥，2010，32（5）：727-730.

[8] 朱磊，王振宇.黑木耳多糖對(duì)小鼠抗疲勞作用的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，30（4）：430-432.

[9] LU Y，WANG D，HU Y，et al. Sulfated modification of epimedium polysaccharide and effects of the modifiers on cellular infectivity of IBDV[J].Carbohydrate Polymers，2008，71（2）：180-186.

[10] LIU C， CHEN H， CHEN K，et al.Sulfated modification can enhance antiviral activities of Achyranthes bidentata polysaccharide against porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） in vitro[J].International Journal of Biological Macromolecules，2013，52：21-24.

[11] ZHANG Y L，ZHANG J B，MO X Y，et al.Modification，characterization and structure-anticoagulant activity relationships of persimmon polysaccharides[J].Carbohydrate Polymers，2010，82（2）：515-520.

[12] CHAN WK，LAW H K W，LIN Z，et al.Response of human dendritic cells to different immunomodulatory polysaccharides derived from mushroom and barley[J]. International Immunology，2007，19（7）：891-899.

[13] MA L S，CHEN H X，ZHANG Y，et al.Chemical modification and antioxidant activities of polysaccharide from mushroom Inonotus obliquus[J].Carbohydrate Polymers，2012，89（2）：371-378.

[14] WEI D F，WEI Y X，CHENG W D，et al.Sulfated modification， characterization and antitumor activities of Radix hedysari polysaccharide[J].International Journal of Biological Macromolecules，2012，51（4）：471-476.

[15] 李公斌，王振宇.黑木耳多糖硫酸酯化制備工藝及紅外光譜分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36（12）：66-68.

[16] STONE A L， MELTON D J， LEWIS M S. Structure-function relations of heparin-mimetic sulfated xylan oligosaccharides inhibition of human immunodeficiency virus-1 infectivity in vitro[J].Glycocon-jugate Journal， 1998，15（7）：697-712.

[17]ZHANG H F，LI B C，F(xiàn)AN J H.Determination of sulfate radical content in sulfated polysaccharides （SPS） by gravimetric analysis of hydrochloric acid hydrolysis and barium sulfate precipation[J].Food Sci，2002，23（5）：107-111.