杜良 鐘愛(ài)華 周兵飛等

摘要[目的] 為研究饑餓脅迫下魚(yú)類(lèi)的生理生化變化提供參考。[方法] 采用傳統(tǒng)瑞氏染色法研究饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細(xì)胞的形態(tài)變化。[結(jié)果] 大鱗副泥鰍的成熟紅細(xì)胞逐漸發(fā)生變化，先出現(xiàn)核膜溶解，然后出現(xiàn)細(xì)胞形變，接著出現(xiàn)核質(zhì)擴(kuò)散和細(xì)胞膜溶解，最后整個(gè)成熟紅細(xì)胞膜完全溶解，核染色反應(yīng)由紫黑色變?yōu)樽霞t色最后變?yōu)榉奂t色。大鱗副泥鰍的幼稚紅細(xì)胞則明顯增多。[結(jié)論] 在饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細(xì)胞出現(xiàn)核異常，主要表現(xiàn)為核膜溶解和核質(zhì)擴(kuò)散，因此紅細(xì)胞核異?？梢宰鳛轲囸I脅迫的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞饑餓脅迫；大鱗副泥鰍；紅細(xì)胞；形態(tài)

中圖分類(lèi)號(hào)S912文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）23-07761-03

基金項(xiàng)目浙江海洋學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（浙海院團(tuán)〔2013〕38號(hào)）；浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201328411）。

作者簡(jiǎn)介杜良（1991-），男，山東濟(jì)寧人，本科生，專(zhuān)業(yè)：水產(chǎn)養(yǎng)殖。*通訊作者，講師，碩士，從事水生生物基礎(chǔ)生物學(xué)研究。

收稿日期20140707大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus），隸屬鯉形目（Cypriniformes）、鰍科（Cobitidae）、花鰍亞科（Cobitinae）、副泥鰍屬（Paramisgurnus），我國(guó)除青藏高原外，各地區(qū)的河川、溝渠、水田、池塘都有大鱗副泥鰍的分布。大鱗副泥鰍肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，是一種高蛋白、低脂肪類(lèi)的高檔營(yíng)養(yǎng)珍品，被人們稱(chēng)為“水中人參”；大鱗副泥鰍還具有較高的藥用價(jià)值，對(duì)肺炎、皮膚搔癢、跌打損傷、手指疔瘡、小便不暢和乳腺癌等均有一定的療效，因此泥鰍是一種生產(chǎn)潛力大、很有發(fā)展前途的養(yǎng)殖品種，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需求量較大[1]。

饑餓是魚(yú)類(lèi)在自然水域生態(tài)系中所必須面對(duì)的一種生理脅迫現(xiàn)象，產(chǎn)生饑餓脅迫的原因有自然界中食物分布在空間上的不均勻性、季節(jié)更替或環(huán)境劇變等，即使在養(yǎng)殖條件下由于養(yǎng)殖密度過(guò)大、個(gè)體間相互競(jìng)爭(zhēng)、投餌不足、投喂技術(shù)不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е卖~(yú)類(lèi)出現(xiàn)因食物短缺而引起的饑餓脅迫[2]。饑餓脅迫既是魚(yú)類(lèi)中經(jīng)常面臨的生理脅迫現(xiàn)象，也是影響?hù)~(yú)類(lèi)正常生長(zhǎng)、發(fā)育和生存的重要環(huán)境因子之一，對(duì)魚(yú)類(lèi)正常生長(zhǎng)、發(fā)育和生存產(chǎn)生重要影響。研究表明，饑餓可以影響?hù)~(yú)類(lèi)代謝、行為、組織結(jié)構(gòu)、存活、繁殖、肌體組成成分、酶活性和恢復(fù)生長(zhǎng)[3-5]。在自然環(huán)境下，因季節(jié)更替大鱗副泥鰍在冬季出現(xiàn)自然停食而處于饑餓狀態(tài)。目前，饑餓脅迫下大鱗副泥鰍紅細(xì)胞形態(tài)的變化尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者研究大鱗副泥鰍饑餓脅迫下紅細(xì)胞的形態(tài)變化，以期為饑餓脅迫下魚(yú)類(lèi)的生理生化變化提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)魚(yú)試驗(yàn)用魚(yú)是由浙江省舟山臺(tái)島鰍業(yè)有限公司提供的同批次大鱗副泥鰍，共82尾。試驗(yàn)開(kāi)始前，將試驗(yàn)魚(yú)放入特定的養(yǎng)殖箱內(nèi)，養(yǎng)殖箱為400 L HDPE水箱，對(duì)試驗(yàn)魚(yú)暫養(yǎng)7 d，以使其適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)及養(yǎng)殖管理在獲得試驗(yàn)用魚(yú)后，將試驗(yàn)魚(yú)平均分到3個(gè)平行養(yǎng)殖箱內(nèi)（水體體積250 L），試驗(yàn)魚(yú)體長(zhǎng)（10±2）cm，初始體重為（15±3）g，每日中午12：00準(zhǔn)時(shí)投喂由浙江省舟山臺(tái)島鰍業(yè)有限公司提供的顆粒飼料，至魚(yú)恰好飽食，進(jìn)行為期10 d的適應(yīng)性暫養(yǎng)，以消除其應(yīng)激性。

適應(yīng)性暫養(yǎng)期間，室溫控制在22 ℃；光照條件為弱光環(huán)境，在白天試驗(yàn)室內(nèi)關(guān)閉窗簾，晚上打開(kāi)窗簾；養(yǎng)殖用水為學(xué)校自來(lái)水系統(tǒng)提供的自來(lái)水，經(jīng)過(guò)48 h的曝氣后注入養(yǎng)殖箱內(nèi)，每48 h換水1次，每次換水125 L；因大鱗副泥鰍所需氧氣量不像其他魚(yú)類(lèi)那么多且其喜靜不喜動(dòng)，因此不放置充氧設(shè)備，以免試驗(yàn)魚(yú)受驚死亡，只通過(guò)換水的方式來(lái)提供其生存所需的氧氣。

經(jīng)過(guò)適應(yīng)性暫養(yǎng)后，便開(kāi)始饑餓試驗(yàn)。饑餓試驗(yàn)期間，溫度、光照和氧氣等條件維持不變，僅停止投喂；每日觀察2次（早12：00和晚19：00），每周二上午10：00進(jìn)行采樣。饑餓時(shí)間為42 d。

1.3樣本采集使用斷尾椎取血法采集樣本。樣本采集時(shí)，從3個(gè)平行養(yǎng)殖箱中各取2條體表完整、行為正常的大鱗副泥鰍，解剖后剪斷尾椎，取血。

1.4血涂片制作取2片準(zhǔn)備好的載玻片，將斷尾處的血液擠出1滴，滴落在載玻片的左端；血滴半徑一般為2 mm；取推片置于玻片的近中心側(cè)，使推片和玻片間成45°～80°角，血膜兩邊留出一定的空隙；將推片向左移動(dòng)，與血滴相接觸；當(dāng)血液沿推片的邊緣分散后，以稍用力而平穩(wěn)的速度向右推。因?yàn)槭侨科?，?次涂片時(shí)血膜較厚，因此進(jìn)行第2次涂片，將推片上的殘血迅速擦干并在玻片上將血膜再次由左向右復(fù)推1次，此時(shí)血膜變得薄而均勻；將涂片置于試驗(yàn)臺(tái)上自然風(fēng)干。

1.5染色采用傳統(tǒng)的瑞氏染色法進(jìn)行染色。使用瑞氏染色液（杭州天和微生物試劑有限公司出品）分別對(duì)8片血涂片進(jìn)行染色，其中甲液（對(duì)氨基苯磺酸0.8 g溶解于100 ml 2.5 mol/L乙酸中）染色45 s，乙液（甲萘胺0.5 g溶解于100 L 2.5 mol/L乙酸溶液）染色7.5 min，然后流水沖洗并干燥。

1.6紅細(xì)胞形態(tài)觀察將染色后的涂片進(jìn)行干燥并置于光鏡下觀察。隨機(jī)選取大鱗副泥鰍血涂片的視野，觀察紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核的染色情況；記錄細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及核膜的形態(tài)，將觀察到的結(jié)果進(jìn)行備注并先使用Canon A3100彩色照相機(jī)進(jìn)行拍照。同時(shí)，將染色效果好的涂片，置于奧林巴斯倒置顯微鏡下進(jìn)行拍片。

2結(jié)果與分析

2.1成熟紅細(xì)胞的形態(tài)大鱗副泥鰍血涂片的有形成分中，紅細(xì)胞占絕大多數(shù)，紅細(xì)胞主要分為成熟紅細(xì)胞和幼稚紅細(xì)胞。大鱗副泥鰍成熟的紅細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，表面光滑。細(xì)胞質(zhì)不能被染色或出現(xiàn)極淡的藍(lán)色。核呈小橢圓形，核小而致密，位于細(xì)胞中央，染色反應(yīng)為紫紅色或紫黑色。

大鱗副泥鰍成熟的紅細(xì)胞形態(tài)2.2幼稚紅細(xì)胞的形態(tài) 泥鰍幼稚紅細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多呈圓形或橢圓形，表面不光滑，部分有不規(guī)則突起。細(xì)胞質(zhì)不能被染色或出現(xiàn)極淡的藍(lán)色。核圓形，位于細(xì)胞中央或稍偏向一側(cè)，染色反應(yīng)為紫紅色或紫黑色（）。

大鱗副泥鰍幼稚紅細(xì)胞的形態(tài)2.3饑餓過(guò)程中紅細(xì)胞的形態(tài)變化饑餓至第7天，可觀察到大量成熟的紅細(xì)胞，細(xì)胞規(guī)則，界限清晰；還能觀察到少量的幼稚紅細(xì)胞，圓形，染色反應(yīng)為紫黑色，直徑略小于成熟紅細(xì)胞的長(zhǎng)徑。同時(shí)，觀察到少量的成熟紅細(xì)胞細(xì)胞核開(kāi)始出現(xiàn)模糊現(xiàn)象，染色反應(yīng)呈淡紫紅色。

饑餓第7天大鱗副泥鰍的紅細(xì)胞形態(tài)饑餓至第14天，依然可以觀察到大量的成熟紅細(xì)胞以及少量的幼稚紅細(xì)胞。但是，核膜溶解現(xiàn)象開(kāi)始增多，部分紅細(xì)胞的細(xì)胞核開(kāi)始擴(kuò)散，溶解擴(kuò)散的核染色反應(yīng)為紫紅色（A），出現(xiàn)極少量完全溶解的細(xì)胞。同時(shí)，部分成熟紅細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生形變，不再維持橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，呈現(xiàn)雨滴狀或豌豆?fàn)睿˙）。

注：A.核膜溶解；B.細(xì)胞形變。

饑餓第14天大鱗副泥鰍的紅細(xì)胞形態(tài)饑餓至第21天，依然能夠觀察到大量成熟紅細(xì)胞及少量幼稚紅細(xì)胞。但是，出現(xiàn)核膜溶解現(xiàn)象的成熟紅細(xì)胞開(kāi)始大量出現(xiàn)，且部分成熟紅細(xì)胞核膜已經(jīng)完全溶解，核質(zhì)已經(jīng)擴(kuò)散，細(xì)胞體積增大，核呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，染色反應(yīng)為淺紫色或粉紅色。細(xì)胞形變進(jìn)一步加劇，細(xì)胞膜溶解增加。

饑餓第21天大鱗副泥鰍的紅細(xì)胞形態(tài)饑餓至第28天，成熟紅細(xì)胞數(shù)量明顯減少，圓形幼稚紅細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始增多（A）。核膜完全溶解，核質(zhì)擴(kuò)散的成熟紅細(xì)胞急劇增多，細(xì)胞已不能維持正常形狀，并且能明顯觀測(cè)到完全溶解的成熟紅細(xì)胞的核質(zhì)，染色反應(yīng)為淺紫色或粉紅色（A）。另一方面，發(fā)生形變的細(xì)胞也急劇增多，多呈現(xiàn)雨滴狀，少數(shù)呈豌豆?fàn)?，且大部分發(fā)生形變的細(xì)胞細(xì)胞膜開(kāi)始溶解（B）。

饑餓至第35天，成熟紅細(xì)胞已急劇減少，且大部分都已發(fā)生形變，與此同時(shí)幼稚紅細(xì)胞含量出現(xiàn)明顯上升。完全溶解的成熟紅細(xì)胞數(shù)量也明顯增加，染色反應(yīng)為粉紅色。

饑餓至第42天，成熟的紅細(xì)胞含量進(jìn)一步減少，只能觀測(cè)到少量未發(fā)生形變的細(xì)胞，同時(shí)能觀察到明顯增多的幼稚紅細(xì)胞。完全溶解的成熟紅細(xì)胞大量出現(xiàn)，染色反應(yīng)為粉紅色。

通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，大鱗副泥鰍成熟紅細(xì)胞含量隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷下降，泥鰍的幼稚紅細(xì)胞相對(duì)數(shù)量明顯增多；形態(tài)上，泥鰍的成熟紅細(xì)胞形態(tài)變化表現(xiàn)為：先出現(xiàn)核膜溶解，然后出現(xiàn)細(xì)胞變形，接著出現(xiàn)核質(zhì)擴(kuò)散和細(xì)胞膜溶解，最后整個(gè)成熟紅細(xì)胞膜完全溶解，核染色反應(yīng)由紫黑色變?yōu)樽霞t色最后變?yōu)榉奂t色。

注：A.細(xì)胞膜完全溶解和核擴(kuò)散；B.細(xì)胞膜溶解。

饑餓第28天大鱗副泥鰍的紅細(xì)胞形態(tài)饑餓第35天大鱗副泥鰍的紅細(xì)胞形態(tài)饑餓第42天大鱗副泥鰍的紅細(xì)胞形態(tài)3 討論

在魚(yú)類(lèi)中，除短腹冰魚(yú)等極少數(shù)南極目魚(yú)類(lèi)沒(méi)有紅細(xì)胞或紅細(xì)胞含量很少外，絕大多數(shù)魚(yú)類(lèi)的紅細(xì)胞含量均占其血細(xì)胞總量的90%以上[6]；該細(xì)胞呈橢圓形或長(zhǎng)橄欖形，表面光滑，成熟紅細(xì)胞中央有1個(gè)圓形或橢圓形細(xì)胞核，與哺乳類(lèi)的無(wú)核成熟紅血細(xì)胞顯著不同[6-7]。在大鱗副泥鰍外周血中能觀察到大量成熟紅細(xì)胞，正常生理狀態(tài)下其外形呈橢圓形，表面光滑，中央有1個(gè)圓形或橢圓形細(xì)胞核。然而，隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，其成熟紅細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了顯著變化，首先出現(xiàn)核膜溶解和細(xì)胞變形現(xiàn)象，然后核膜完全溶解核質(zhì)擴(kuò)散和細(xì)胞膜溶解，最后細(xì)胞膜完全溶解，僅剩下擴(kuò)散的核質(zhì)，稱(chēng)為核影[7]，染色反應(yīng)呈粉紅色。脾臟是魚(yú)類(lèi)造血、過(guò)濾血液和破壞衰老紅細(xì)胞的中心場(chǎng)所。隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，大鱗副泥鰍外周血中出現(xiàn)大量的紅細(xì)胞核影，可能是因?yàn)轲囸I不僅影響了紅細(xì)胞的形態(tài)，還影響了大鱗副泥鰍的脾臟功能，使其過(guò)濾血液和破壞衰老紅細(xì)胞的功能下降，導(dǎo)致大量被破壞的紅細(xì)胞無(wú)法自然清除。

魚(yú)類(lèi)紅細(xì)胞與哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞一樣，其主要機(jī)能為運(yùn)輸O2和CO2，同時(shí)緩沖機(jī)體產(chǎn)生的酸堿物質(zhì)以及維護(hù)體內(nèi)離子平衡等。隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，大量成熟紅細(xì)胞遭到破壞，為了維持運(yùn)輸氧氣和二氧化碳等生理功能，大鱗副泥鰍外周血中幼稚紅細(xì)胞的數(shù)量不斷增加。魚(yú)類(lèi)造血器官除了脾臟外，還有腎臟等器官參與造血。在饑餓脅迫下，真正參與造血的器官還需進(jìn)一步研究。

42卷23期杜 良等饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細(xì)胞的形態(tài)變化由于某些因素造成紅細(xì)胞膜破裂和胞質(zhì)外溢，而其核仍能在血液中存在一段時(shí)間，這種主要是核質(zhì)的紅細(xì)胞被稱(chēng)為“核影”紅細(xì)胞，由成熟紅細(xì)胞到“核影”紅細(xì)胞的過(guò)渡類(lèi)型為分解紅細(xì)胞，“核影”紅細(xì)胞是紅細(xì)胞衰老過(guò)程中的形態(tài)表現(xiàn)，主要與魚(yú)體自身的生理狀態(tài)有關(guān)[8]。筆者發(fā)現(xiàn)在饑餓脅迫下隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，能觀察到成熟紅細(xì)胞、分解紅細(xì)胞和“核影”紅細(xì)胞。1982年，Hooftman[9]等首次證實(shí)化學(xué)誘變劑甲醛磺酸乙酯（EMS）能誘發(fā)泥蔭魚(yú)外周紅細(xì)胞微核形成及核異常。筆者也發(fā)現(xiàn)在饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細(xì)胞出現(xiàn)核異常，主要表現(xiàn)為核膜溶解，核質(zhì)擴(kuò)散，因此紅細(xì)胞核異常可以作為饑餓脅迫的指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

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