郭曉慶 金鉞 顧陽 潘鑫龍 喬涵 陳紅英

摘要 [目的] 探索雞白細胞介素-18（IL-18）在H₉禽流感（AI）滅活油乳苗免疫中的免疫佐劑作用。[方法] 從雞脾淋巴細胞中克隆雞IL-18基因，亞克隆到真核表達載體pcDNA3.1（+）中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pIL-18。將重組真核表達質(zhì)粒pIL-18、H₉亞型AI滅活油乳苗及其二者聯(lián)合分別免疫14日齡SPF雞，檢測其細胞免疫和體液免疫水平，評價雞IL-18在H₉亞型禽流感滅活油乳苗中的免疫增強作用。[結(jié)果]成功克隆了雞IL-18全基因，大小為597 bp。質(zhì)粒pIL-18和H₉亞型AI滅活油乳苗聯(lián)合免疫的SPF雞所產(chǎn)生的HI抗體效價在接種第4周后明顯高于H₉亞型AI滅活油乳苗免疫組；其T淋巴細胞的增殖反應(yīng)也強于H₉亞型AI滅活油乳苗免疫組。[結(jié)論] 質(zhì)粒pIL-18能提高H₉亞型禽流感滅活油乳苗誘發(fā)的免疫應(yīng)答，為研究防制禽流感的新型疫苗提供了新思路。

關(guān)鍵詞 雞白細胞介素-18；真核表達；H₉亞型禽流感病毒；滅活疫苗

中圖分類號 S831 文獻標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）26-09048-03

Immune Enhancement Effects of Chicken Interleukin-18 on Inactivated Oil Emulsion Vaccine of H₉Subtype Avian Influenza

GUO Xiao-qing， CHEN Hong-ying et al （College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450002）

Abstract [Objective] The research aimed to explore the immune adjuvant effect of interleukin-18（IL-18） in the immunization of inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza. [Method] Chicken IL-18 gene was amplified from total RNA extracted from chicken spleen lymphocytes. PCR product was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1（+） to construct eukaryotic expression vector pIL-18. The recombinant eukaryotic expression vector pIL-18， inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza and the mixture were used to immunize 14-day-old SPF chicken and detect its cellular immunity and humoral immunity levels. The immune enhancement effects of chicken on inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza were evaluated. [Result] Total IL-18 gene of chicken was successfully cloned， and its length was 597 bp. The titers of HI antibody produced in SPF chicken immunized with plasmid pIL-18 and inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza in the four weeks after inoculation were obviously higher than that in inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza. Its multiplication response of T lymphocyte was stronger than that in inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza group. [Conclusion] Plasmid pIL-18 could enhance the immune response induced by inactivated oil emulsion vaccine of H₉subtype avian influenza， which provided a new thought for studying and developing new vaccines of avian influenza.

Key words Chicken interleukin-18； Eukaryotic expression； H₉subtype avian influenza virus； Inactivated vaccine

近年來，由H₉亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽流感（Avian influenza，AI）在我國部分地區(qū)廣泛流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。油乳劑滅活苗雖然對該亞型禽流感的控制發(fā)揮了重要作用，但是其免疫效力尤其細胞免疫作用受到了限制；弱毒疫苗存在潛在的安全問題；基因工程亞單位疫苗和DNA疫苗雖具有應(yīng)用潛力，但也需要提高其免疫、尤其細胞免疫效果。

白細胞介素-18（IL-18）又稱為IFN-γ誘導(dǎo)因子（Okamura et al.，1995），具有多種生物學(xué)功能。它能刺激Th1等細胞產(chǎn)生IFN-γ、GM-CSF、IL-2等細胞因子，增強Fas介導(dǎo)的細胞毒作用，促進T細胞的增殖，因此IL-18在抗病毒、抗腫瘤、抗超敏反應(yīng)等方面具有潛在的應(yīng)用前景^[1-3]。雞IL-18與IL-18具有相同的功能，是一種新型的細胞免疫調(diào)節(jié)因子，可以顯著刺激Thl細胞產(chǎn)生IFN-γ^[4-6]。國內(nèi)盡管也有人

研究雞IL-18重組真核表達質(zhì)粒對雞用疫苗的免疫增強作用^[7]，但與國外研究相比較，目前國內(nèi)尚未見到雞IL-18重組真核表達質(zhì)粒對H₉亞型AI滅活油乳苗免疫增強作用的研究報道。筆者從雞脾淋巴細胞中克隆雞IL-18基因，亞克隆到真核表達載體pcDNA3.1（+）中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pIL-18。將重組真核表達質(zhì)粒pIL-18、H₉亞型AI滅活油乳苗及其二者聯(lián)合分別免疫14日齡SPF雞，檢測其細胞免疫和體液免疫水平，以評價雞IL-18在H₉亞型禽流感滅活油乳苗中的免疫增強作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、抗原及主要試劑。

Ex Taq DNA聚合酶、DNA marker DL2000、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ等，均購自寶生物工程（大連）有限公司。QIAQuick Gel Extraction Kit為Qiagen公司產(chǎn)品。動物總RNA快速提取試劑盒（Trizol-離心柱法）為上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品。Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit為ThermoFisher Scientific公司產(chǎn)品。真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1、LipofectamineTM 2000 Reagent均購自Invitrogen公司。細胞培養(yǎng)基DMEM購自Gibco BRL公司。刀豆素（ConA）、甲基噻唑基四唑（MTT）試劑和淋巴細胞分離液等均購自北京索萊寶科技有限公司。H₉亞型AI滅活油乳苗和H₉亞型禽流感HA抗原均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.2 試驗雞。

1日齡SPF雞購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，試驗期間飼養(yǎng)于隔離器中。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及大量制備

采用動物總RNA快速提取試劑盒從雞脾淋巴細胞中提取總RNA，根據(jù)Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用雞IL-18特異引物^[8]擴增雞IL-18全基因。用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切回收的PCR產(chǎn)物，電泳、分離和回收0.6 kb的雞IL-18片段，定向插入到同樣處理的真核表達載體pcDNA3.1中，構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/IL-18（簡稱pIL-18），轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞。將通過PCR和酶切鑒定初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序，以驗證目的基因的核苷酸序列及閱讀框架的正確性。

將含有重組質(zhì)粒pIL-l8的細菌擴大培養(yǎng)，用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，聚乙二醇純化。使用紫外分光光度計測定其含量，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗動物分組及免疫

將120只14日齡SPF雞隨機分成4組，30羽/組：Ⅰ組為單疫苗免疫組，用H₉亞型AI滅活油乳苗后頸皮下注射SPF雞，0.5 ml/羽；Ⅱ組為質(zhì)粒pIL-l8與疫苗聯(lián)合免疫組，將H₉亞型AI滅活油乳苗于后頸部皮下注射SPF雞，同時于腿部肌肉多點注射質(zhì)粒pIL-l8，200 μg/羽；Ⅲ組為pIL-l8質(zhì)粒免疫組，于腿部肌肉多點注射質(zhì)粒pIL-l8，200 μg/羽；Ⅳ組為質(zhì)粒pcDNA3.1（+）對照組，于腿部肌肉多點注射質(zhì)粒pcDNA3.1（+），200 μg/羽。免疫后第1、2、3、4、5和6周，隨機抽取每組5只雞進行翅靜脈采血，分離血清，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（MTT法）

免疫后1～6周，每周隨機無菌心臟采集每組5只雞肝素抗凝血2 ml，參考文獻[8]中方法進行雞淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。

1.5 微量血凝抑制試驗

采用微量血凝抑制（Hemagglutination inhibition，HI）試驗^[9]，對采集的新鮮雞血清進行HI抗體效價檢測。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 利用SPSS軟件包采用方差分析法對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞IL-18基因的擴增

應(yīng)用雞IL-18特異性引物，通過RT-PCR擴增出雞IL-18全基因，電泳出現(xiàn)1條約600 bp大小的DNA帶（圖1），與預(yù)期擴增片段大小相符。測序結(jié)果表明，雞IL-18全長為597 bp，包含1個完整的開放閱讀框，其核苷酸序列與Schneider等^[4]報道的雞IL-18基因核苷酸序列同源性為100%。

2.2 雞IL-18真核表達質(zhì)粒對H₉亞型禽流感HI抗體的影響

從圖2可以看出，質(zhì)粒pIL-l8與疫苗聯(lián)合免疫組和單疫苗免疫組的HI抗體水平從免疫后第1周迅速升高，第4周達到高峰，此后又逐漸下降，直到第6周仍處于較高水平。免疫后前3周內(nèi)，pIL-18質(zhì)粒和H₉亞型AI滅活油乳苗聯(lián)合免疫的SPF雞，其HI抗體效價與H₉亞型AI滅活油乳苗免疫SPF雞的HI抗體效價無顯著差異（P>0.05），但是在免疫接種第4周后，二者差異顯著（P< 0.05），而pIL-18組和pcDNA3.1（+）組一直處于未免疫的抗體水平，第4周后逐漸下降至0。

2.3 雞IL-18表達質(zhì)粒對雞的安全性和脾T淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響

在免疫后的不同時期，分別采取每組SPF雞外周抗凝血，分離T淋巴細胞，經(jīng)ConA刺激后應(yīng)用MTT法測定T淋巴細胞的增殖動態(tài)。從圖3可以看出，免疫第3～6周，pIL-18和H₉亞型AI滅活油乳苗聯(lián)合免疫組的OD值明顯高于H₉亞型AI滅活油乳苗免疫組，差異極顯著（P<0.01）；pIL-l8質(zhì)粒免疫組的OD值也顯著高于注射pcDNA3.1（+）組（P<0.05）。這表明用質(zhì)粒pIL-18與H₉亞型AI滅活油乳苗聯(lián)合免疫，比單用H₉亞型AI滅活油乳苗免疫SPF雞T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能有明顯提高。

3 討論

IL-18是1995年新發(fā)現(xiàn)的一種重要細胞因子，能誘導(dǎo)Th1等細胞產(chǎn)生大量IFN-γ的表達來提高機體免疫應(yīng)答，尤其是細胞免疫應(yīng)答，而且其誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的能力比IL-12強，可以直接激活I(lǐng)FN-γ的啟動子，因此IL-18可作為疫苗的免疫佐劑。筆者從雞脾淋巴細胞中克隆出雞IL-18基因，并將雞IL-18基因重組到真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1（+）中，成功構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pIL-18，為雞IL-18功能蛋白的有效表達及其對禽用疫苗的免疫增強作用奠定了基礎(chǔ)。

該試驗結(jié)果表明構(gòu)建的質(zhì)粒pIL-18與H₉亞型AI滅活油乳苗聯(lián)合免疫SPF雞所產(chǎn)生的HI抗體效價，在接種后的前3周內(nèi)與H₉亞型AI滅活油乳苗免疫組雖無明顯差異（P>0.05），但在接種后第4、5及6周差異顯著（P<0.05）；同時，T淋巴細胞的增殖反應(yīng)從接種后第3周開始即與H₉亞型AI滅活油乳苗接種組差異明顯（P<0.05），但是這種作用在接種后的2周內(nèi)較弱，僅在2周后方呈現(xiàn)出明顯的免疫增強作用，表明重組真核表達質(zhì)粒DNA通過肌肉進入機體后需經(jīng)過一定時間方可得到良好表達，這與Su B S等^[10]報道的相一致。這表明質(zhì)粒pIL-18不僅具有明顯的增強H₉亞型AI滅活油乳苗誘導(dǎo)細胞免疫的作用，而且對HI抗體水平的提高也具有一定的作用。另外，大量資料還表明IL-18能夠增強IL-2的產(chǎn)生，提高NK細胞和CTL細胞的生物學(xué)活性，這些對提高疫苗的免疫效果都具有十分重要的意義。

參考文獻

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