焦豪妍 ，王 英 ，陳麗莉 ，湯慶發(fā)

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院中藥研究所，廣東 廣州 510520； 2.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632； 3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515）

何首烏又稱首烏、赤首烏，為蓼科植物何首烏 Radix Polygonum multiflori的干燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便的功效，常用于治療瘰疬瘡癰、風(fēng)疹瘙癢、久瘧體虛、腸燥便秘等[1]。其化學(xué)成分主要有羥基蒽醌類化合物（主要為大黃素、大黃酚、大黃酸等葡萄糖苷），醌類化合物，二苯乙烯苷類化合物，酰胺類化合物，色原酮類化合物，卵磷脂，微量元素鈣、鐵、鋅、錳、銅等[2－7]。藥理學(xué)研究表明，何首烏久服能延年不老；能入血分，消痰毒；能止心痛，益血?dú)?；能調(diào)氣血、肝風(fēng)；能專入腎，益精髓；能補(bǔ)肝腎，入肝腎脾經(jīng)；何首烏功效中之烏發(fā)相關(guān)的藥理作用研究有待進(jìn)一步深入[8－14]。何首烏主產(chǎn)于廣東、河南、山東、廣西等多個(gè)省區(qū)，其中廣東德慶產(chǎn)何首烏種植歷史悠久、品質(zhì)優(yōu)，是何首烏的道地品種。本試驗(yàn)中建立了何首烏藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，對(duì)13批樣品進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，并對(duì)7個(gè)主要成分進(jìn)行了化學(xué)指認(rèn)，采用SPSS軟件通過聚類分析將樣品聚為Ⅱ類，為何首烏藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀系統(tǒng)(包括四元泵、真空在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測(cè)器及Agilent色譜工作站)；KQ3200E型超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司)；Sartorius BP211D型十萬分之一電子分析天平；Jinteng Science溶劑過濾器；四兩裝高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)；相似度評(píng)價(jià)軟件(中國(guó)藥典會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件2004A版》)。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為去離子水；何首烏藥材購(gòu)自德慶市道地產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)地為德慶市余家巷村，經(jīng)暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所周光雄教授鑒定，為蓼科植物何首烏的干燥塊根。13批次何首烏藥材來源見表1。對(duì)照品包括沒食子酸、表兒茶素、2，3，5，4′－四羥基順式二苯乙烯 －2－O －β－D －葡萄糖苷、2，3，5，4′－四羥基反式二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷、決明酮－8－O－β－D－葡萄糖苷、大黃素 －8－O－β－D－葡萄糖苷、大黃素，均由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得，采用UV，MS，1H及13C NMR等光譜方法確定其結(jié)構(gòu)。

表1 何首烏藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

精密稱取各對(duì)照品適量，置5 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取何首烏干燥藥材粉碎，過60目篩，精密稱取粉末2.0 g，置100 mL錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 mL，精密稱定質(zhì)量，超聲提取60 min(250 W，40 kHz)，溫度40℃。放置至室溫后，精密稱定質(zhì)量，以50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得供試品溶液。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：XtimateTMC18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A相）－0.1%甲酸水溶液（B相），梯度洗脫程序，B相0～5 min（15% ～15% ），5～30 min（15% ～40% ），30～45 min（40% ～65% ），45～60 min（65% ～100% ）；流速：1.0 mL /min；柱溫：25 ℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：10 μL。所有色譜峰均達(dá)到基線分離，且在60 min內(nèi)完成檢測(cè)，理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜。結(jié)果相似度均大于0.9，共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明方法儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.1項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄指紋圖譜。結(jié)果相似度值均大于0.9，共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積 RSD小于3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取 2.1 項(xiàng)下供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣，檢測(cè)指紋圖譜，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版軟件計(jì)算相似度。結(jié)果均大于0.9，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值無明顯變化，RSD值均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 相似度計(jì)算

運(yùn)用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)》對(duì)13批何首烏藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，通過中位數(shù)矢量計(jì)算得出何首烏樣品指紋圖譜的共有模式進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。

2.4 指紋圖譜分析及評(píng)價(jià)

共有模式指紋圖譜的建立：取13批何首烏樣品，以2.1項(xiàng)下方法分別制備成供試品溶液，采用擬訂的HPLC色譜條件進(jìn)行測(cè)試，記錄各自的色譜圖(圖1)。將13批何首烏藥材樣品指紋圖譜的AIA數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A2.0版》軟件進(jìn)行分析，時(shí)間窗0.1，中位數(shù)法，以11號(hào)峰(大黃素)為參照峰，經(jīng)多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配后生成何首烏藥材的對(duì)照指紋圖譜，并確定了11個(gè)共有峰，何首烏藥材對(duì)照指紋圖譜(共有模式)見圖 2。

圖1 13批何首烏藥材樣品的HPLC指紋圖譜

圖2 何首烏藥材對(duì)照指紋圖譜(共有模式)

相似度評(píng)價(jià)：將13批何首烏藥材樣品指紋圖譜的AIA數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)》軟件，計(jì)算各樣品指紋圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜 R的相似度。結(jié)果見表2?？梢?，除第8批藥材樣品相似度稍差外，其他批次樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.924～0.994之間。

表2 何首烏藥材相似度計(jì)算結(jié)果

相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積：為更好地說明相似度結(jié)果，選擇13批何首烏藥材樣品的指紋圖譜其中5個(gè)明顯的共有峰，其保留時(shí)間依次為 13.34，17.10，33.75，36.10，47.16 min。以 11 號(hào)峰(大黃素)為參照峰，統(tǒng)計(jì)相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD。結(jié)果顯示，13批供試品指紋圖譜主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 1.0%，但相對(duì)峰面積的 RSD差異較大，在 0～96.91%之間，說明各批次何首烏藥材樣品整體具有一定的相似性，但部分色譜峰所代表的化學(xué)成分含量有較大差異。

2.5 聚類分析

系統(tǒng)聚類分析是一種無管理、無指導(dǎo)的模式識(shí)別方法，根據(jù)所測(cè)樣品的色譜指紋圖譜特征，對(duì)樣品進(jìn)行分類。應(yīng)用SPSS 130軟件，采用分層聚類分析方法以歐式距離作為樣本間的相似性測(cè)定，采用組間聯(lián)結(jié)法 (between－groups linkage)測(cè)度。聚類分析結(jié)果見圖3。當(dāng)聚合距離為25時(shí)，13批樣品大體上聚為Ⅱ類，樣本9，10，11，12，13為第 1類，其余樣本為第 2類。結(jié)合色譜圖觀察，此分類情況與樣本來源情況和相似度結(jié)果吻合。

圖3 13批樣本聚類分析結(jié)果

2.6 主要色譜峰的化學(xué)指認(rèn)

取何首烏藥材樣品(第7批)，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液；取本課題組從何首烏中分離得到的7個(gè)化學(xué)對(duì)照品適量，按2.1項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液；以 2.2項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)比7個(gè)對(duì)照品的色譜保留行為，何首烏藥材樣品HPLC指紋圖譜中 1，2，4，5，7，8，11 號(hào)峰得到了明確的化學(xué)指認(rèn)。結(jié)果見圖4?？梢姡刚J(rèn)的色譜峰占總峰面積80%，占共有峰面積的90%。

圖4 何首烏HPLC指紋圖譜及7個(gè)主要色譜峰對(duì)照品的HPLC圖譜疊加圖

3 討論

本研究中在提取、測(cè)試條件等方面經(jīng)過大量試驗(yàn)摸索，建立了13批不同來源廣東道地藥材何首烏的HPLC指紋圖譜。結(jié)果表明，13批何首烏藥材對(duì)照?qǐng)D譜中主要色譜峰的整體圖貌基本一致，與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均較好，但何首烏樣品中主成分的色譜峰峰面積均相差較大，推測(cè)是由于采摘季節(jié)和生長(zhǎng)環(huán)境的影響，導(dǎo)致批次樣品的各化學(xué)成分含量不一。另外，采用SPSS軟件對(duì)13批藥材進(jìn)行了聚類分析，依據(jù)指紋特征，將藥材聚為Ⅱ類。

與以往何首烏指紋圖譜的研究[15－20]不同，本研究中在對(duì)何首烏的化學(xué)成分進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)上，前期分離和鑒定了其主要有效成分，除了形成良好的指紋圖譜，還采用課題組分離得到的標(biāo)準(zhǔn)品指認(rèn)了7個(gè)主要有效成分，確定了其化合物結(jié)構(gòu)，所指認(rèn)的色譜峰占總峰面積80%。該指紋圖譜簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，對(duì)鑒別藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣有一定的參考價(jià)值。

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