李 凌 朱晉嫻

(徐州醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

通過實(shí)驗(yàn)表征，研究藥物的作用機(jī)理，實(shí)際上就是研究藥物與靶點(diǎn)的相互作用，結(jié)合計(jì)算化學(xué)，分別成為藥物分子設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。人血清白蛋白HSA是血漿中含量最高的蛋白質(zhì)，是不同組織氨基酸的主要來源，又是大量內(nèi)源性物質(zhì)如長鏈脂肪酸﹑膽紅素及外源性物質(zhì)如藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它可以攜帶藥物至作用靶點(diǎn)，進(jìn)而發(fā)揮藥物的活性。藥物與白蛋白的不同鍵合會(huì)影響到藥物的治療作用﹑藥代動(dòng)力學(xué)及其毒性，同時(shí)也對(duì)藥物在體內(nèi)的分布起著重要的作用。

以香豆素環(huán)為母核，通過引入磺酰脲結(jié)構(gòu)，根據(jù)孿藥的原理合成了一系列降血糖的香豆素衍生物[1]，其中代號(hào)為SU-118的新化合物（見結(jié)構(gòu)圖）經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)顯示具有良好的降血糖作用。由于SU-118是由兩個(gè)有效基團(tuán)拼合而成，而這兩個(gè)有效基團(tuán)的降糖機(jī)制并不相同，所以這個(gè)新化合物完全有可能同時(shí)兼?zhèn)鋬煞N機(jī)制或者在體內(nèi)有新的作用機(jī)制從而使其降糖作用明顯。因此，該化合物有望成為一種不同于磺酰脲類藥物的新型降血糖藥物。研究SU-118與血清白蛋白的相互作用對(duì)理解此類藥物的作用機(jī)理以及進(jìn)行藥物篩選具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

本文采用分子對(duì)接方法進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)，該方法是指在分子模擬環(huán)境中，兩個(gè)或兩個(gè)以上的分子模型通過幾何形狀，化學(xué)環(huán)境以及能量的匹配形成最佳結(jié)合的技術(shù)。準(zhǔn)確地分子對(duì)接是研究分子作用機(jī)理和設(shè)計(jì)分子的基礎(chǔ)。為了盡可能保證其可靠性，共采用了兩種模擬軟件，分別是ICM和CAChe軟件。

ICM軟件的主要功能是將柔性的配體分子對(duì)接在能量最佳的位置上。這個(gè)能量包含著基于ECEPP/3力場(chǎng)下的配體的內(nèi)部能量，同時(shí)還有范得華力，氫鍵，靜電和疏水的配體或受體的相互作用。ICM程序在內(nèi)在的調(diào)整時(shí)間內(nèi)是用來發(fā)現(xiàn)能量最小的位置。每一個(gè)運(yùn)算規(guī)則的步驟都是由遵循局部能量最小化原則的兩種類型（扭轉(zhuǎn)和位置）的任意構(gòu)像改變組成的。扭轉(zhuǎn)移動(dòng)包括完全隨機(jī)的轉(zhuǎn)變一個(gè)任意的扭轉(zhuǎn)角。位置移動(dòng)包括整個(gè)配體作為整體進(jìn)行類似于布朗運(yùn)動(dòng)的平移和旋轉(zhuǎn)。ICM運(yùn)用梯度最小化分析，發(fā)現(xiàn)能量的局部最小化比單一最小化和隨機(jī)的獨(dú)自搜索進(jìn)行的更快。為了改進(jìn)集中，可以多次從不同位置開始運(yùn)行。ICM的VLS得分功能是由配體內(nèi)部的力場(chǎng)能量和配體與受體相互作用的能量組成的。而后者包括范德華力，基于已接近溶劑的表面的疏水作用，靜電溶劑化作用和氫鍵作用。

CAChe軟件的主要功能是運(yùn)用遺傳算法（GA）來使小分子對(duì)接入蛋白質(zhì)分子。這種遺傳算法是基于已知蛋白質(zhì)庫里的蛋白質(zhì)與配體的結(jié)構(gòu)信息來推測(cè)兩個(gè)分子的可能嵌入方式。

2 結(jié)果與討論

已有的光譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SU-118應(yīng)鍵合在HSA的ⅡA和ⅢA位置，通過Cache軟件觀察ⅡA和ⅢA位置的蛋白質(zhì)表面確有可供藥物分子進(jìn)入的縫隙，在人血清白蛋白上僅有幾個(gè)專一的藥物鍵合點(diǎn)，最主要的是位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ[2]。位點(diǎn)Ⅰ是華法令和保泰松等類似物的鍵合位點(diǎn)，也叫華法令鍵合位點(diǎn)，它定位于HSA上靠近色氨酸214的亞結(jié)構(gòu)域ⅡA區(qū)的疏水內(nèi)腔中，而安定和arylpropionic acid等主要鍵合于位點(diǎn)Ⅱ，位于HSA上的亞結(jié)構(gòu)域ⅢA區(qū)的疏水內(nèi)腔中，位點(diǎn)Ⅱ也叫苯并二氮/吲哚鍵合位點(diǎn)。

若是在ⅡA位置上進(jìn)行分子對(duì)接，定義的活性位置如下圖所示：

其中含有21個(gè)殘基K195,K199,F211,W214,A215,V216,R218,L219,R222,F223,V235,L238,V241,H242,R257,L260,A261,I264,S287,I290,A291。這些殘基中有四個(gè)基團(tuán)（R218,R222,H242,R257）是親水基團(tuán)，底部屬于ⅡA位置上的疏水腔。其入口處有殘基K195,K199,R257,A291。

用藥物分子SU-118進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖：

Docking Score為-106.998kcal/mole。小分子對(duì)接后，其苯環(huán)位置先進(jìn)入腔內(nèi)，位于疏水的口袋底部，香豆素環(huán)部分則位于口袋口附近。SU-118與1N5U上的殘基W214的最近距離為3.504A。

HSA分子上有三個(gè)內(nèi)在芳環(huán)熒光團(tuán)：色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸，其中色氨酸的熒光變化常用來探測(cè)HSA構(gòu)象變化的信息[3]。色氨酸熒光的猝滅，表明在SU-118-HSA體系中，SU-118在色氨酸附近鍵合，色氨酸被引入更親水的環(huán)境。在HSA分子上只有一個(gè)定位于亞結(jié)構(gòu)域ⅡA疏水口袋中的214位色氨酸，其熒光的猝滅可能是由于SU-118鍵合于亞結(jié)構(gòu)域ⅡA的疏水口袋附近而引起的。而模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到SU-118與W214的距離為3.504A,而探針與W214的距離為4.970A，可以看出SU-118比探針更加接近W214。由得分看出，丹酰胺分子對(duì)接后得分僅有-69.863kcal/mole,而SU-118的得分為-106.998kcal/mole,docking的效果比丹酰胺好很多，由此可以推斷出SU-118應(yīng)該比較容易取代探針鍵合在ⅡA位置，嵌入ⅡA位置的疏水腔中。

如果在ⅢA位置進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，定義的活性位置如下：

一共有25個(gè)殘基S342,V344,L345,R348,P384,L387,I388,N391,C392,F403,L407,R410,Y411,L430,G431,V433,G434,C438,M446,A449,E450,L453,R485,P486,S489。其中有 R348,N391,R410,E450,R485五個(gè)殘基是親水基團(tuán)。入口處周圍有四個(gè)殘基R410,Y411,L387，S489。用SU-118進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)得分為-78.096kcal/mole。

在ⅢA位置進(jìn)行docking與在ⅡA位置類似，SU-118與丹酰肌氨酸也為競(jìng)爭性鍵合，SU-118的得分為-78.096kcal/mole,而丹酰肌氨酸的只有-47.328kcal/mole,由此可見SU-118可以取代丹酰肌氨酸的位點(diǎn)，即HSA上的位點(diǎn)Ⅱ。同樣是小分子嵌入疏水腔中，由得分可知，小分子結(jié)合在ⅡA位置得分為-106.998kcal/mole,而結(jié)合在ⅢA位置得分為-78.096kcal/mole,所以在ⅡA位置小分子結(jié)合得比在ⅢA位置更好，由此可知SU-118對(duì)位點(diǎn)Ⅰ的親和力更強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過模擬實(shí)驗(yàn)可以知道，藥物分子SU-118在ⅡA位置與HSA鍵合可以取代探針丹酰胺，在ⅢA位置鍵合可以取代丹酰肌氨酸，并且SU-118對(duì)ⅡA位置的親和力比對(duì)ⅢA位置更強(qiáng)。

［1］Han,Y.,Tu,S.Z.,Zhou,W.et al.J.Chin.Pharm.Univ[J].2002,33,93.

［2］Sudlow,G.,Birkett,D.J.,Wade,D.N.Mol.Pharmacol[J].1975,11,824.

［3］Trynda-Lemiesz,L.,Keppler,B.K.,Koztowski,H.et al.J.Inorg.Biochem[J].1999,73,123.