王洪水

(馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，湖北 武漢 430064)

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益氣通便顆粒微生物限度檢查法研究

王洪水

(馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，湖北 武漢 430064)

目的：建立益氣通便顆粒微生物限度檢驗(yàn)方法。方法：按《中國(guó)藥典》2010版附錄微生物限度檢查法的驗(yàn)證試驗(yàn)指導(dǎo)原則，采用培養(yǎng)基稀釋法和常規(guī)法對(duì)三個(gè)批號(hào)的益氣通便顆粒進(jìn)行微生物限度測(cè)定。結(jié)果：各菌種的回收率均大于70%，在控制菌常規(guī)法驗(yàn)證中實(shí)驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌；通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證表明，細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查可采用培養(yǎng)基稀釋法檢驗(yàn)，控制菌可采用常規(guī)法進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)論：建立的益氣通便顆粒微生物限度檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠、可行性強(qiáng)，能有效地對(duì)其進(jìn)行微生物限度的測(cè)定。

益氣通便顆粒；常規(guī)法；培養(yǎng)基稀釋法；方法驗(yàn)證

益氣通便顆粒為口服給藥制劑，由何首烏、枳殼、升麻、火麻仁、白術(shù)、炙黃芪、肉蓯蓉等七味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、潤(rùn)腸通便之功效。用于中老年氣陰兩虛、氣機(jī)升降失常、腸道失運(yùn)引起的便秘，癥見(jiàn)大便干結(jié)，或大便稀軟難解，肛門(mén)墜脹，努掙無(wú)力，便后疲憊，舌淡胖而少津，或舌紅少苔，脈虛無(wú)力，或細(xì)澀無(wú)力。為了有效地對(duì)益氣通便顆粒進(jìn)行微生物限度測(cè)定，準(zhǔn)確檢出樣品中存活的微生物數(shù)量及致病菌種類(lèi)[1-3],特研究了其微生物限度的檢查方法并進(jìn)行了方法驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

白色念珠菌CMCC(F)98001、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、黑曲霉CMCC(F)98003、大腸埃希菌CMCC(B)44102由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 樣品

益氣通便顆粒(馬應(yīng)龍藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120601、131001、131101)。

1.3 培養(yǎng)基

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(BR 021011)、MUG培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(BR)、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)(伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(BR)、改良馬丁培養(yǎng)基(BR)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)、pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(OWD-M0151)以及0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液等。

1.4 儀器

天平、培養(yǎng)箱、冰箱、微波爐、高壓滅菌鍋等。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

①取經(jīng)35℃培養(yǎng)24h的大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1mL，加適量0.9%無(wú)菌NaCl溶液制成細(xì)菌數(shù)為50～100cfu/mL的菌液，做活菌計(jì)數(shù)備用。②取經(jīng)25℃培養(yǎng)24h以改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1mL，加適量0.9%無(wú)菌NaCl溶液制成細(xì)菌數(shù)為50～100cfu/mL的菌液，做活菌計(jì)數(shù)備用。③將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種到斜面改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)25℃培養(yǎng)1周，加5mL0.9%無(wú)菌NaCl溶液洗下斜面的霉菌孢子，然后吸取洗下的孢子液用適量0.9%無(wú)菌NaCl溶液制成細(xì)菌數(shù)為50～100cfu/mL的菌液，備用。

2.2 供試液的制備方法

取樣品10g研碎，加入適量pH7.0的無(wú)菌NaCl-蛋白胨緩沖液使溶解并稀釋至100mL，制成1∶10的供試液備用；取以上供試液1mL注皿。常規(guī)法，取1∶10的供試液1mL注皿；培養(yǎng)基稀釋法，取1∶10的供試液1mL注入5個(gè)平皿中。

2.3 回收率試驗(yàn)

菌液組：取上述各菌液1mL分別注入平皿中，立即注入瓊脂，待凝固后，細(xì)菌35℃培養(yǎng)72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養(yǎng)120h；平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定各菌株的實(shí)驗(yàn)菌數(shù)。

試驗(yàn)組：取上述供試液和不同菌液各1mL分別注入同一平皿中，平行制備2個(gè)平皿。立即注入瓊脂，待凝固后，細(xì)菌35℃培養(yǎng)72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養(yǎng)120h；平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定各菌株的實(shí)驗(yàn)菌數(shù)。

供試品對(duì)照組：取上述供試液1mL注入平皿中，立即注入瓊脂，待凝固后，細(xì)菌35℃培養(yǎng)72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養(yǎng)120h；平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

稀釋劑對(duì)照組：取pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1mL和上述不同菌液1mL，分別注入同一平皿中，立即注入瓊脂，待凝固后，細(xì)菌35℃培養(yǎng)72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培養(yǎng)120h；平行制備2個(gè)平皿，考察稀釋劑對(duì)試驗(yàn)有無(wú)干擾。該對(duì)照組各試驗(yàn)菌的回收菌應(yīng)不低于70%。

2.4 驗(yàn)證方法

2.4.1 常規(guī)法 取3個(gè)批號(hào)的益氣通便顆粒，按常規(guī)法測(cè)定每一株菌的實(shí)驗(yàn)菌數(shù)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌的回收率。結(jié)果表明，大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌和黑曲霉回收率均大于70%，而金黃色葡萄球菌回收率小于70%[4]，表明益氣通便顆粒對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。對(duì)霉菌和酵母菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，可采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌和酵母菌測(cè)定，采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)測(cè)定檢驗(yàn)不可行。pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋劑對(duì)照組回收率超過(guò)70%，表明稀釋劑無(wú)抑菌作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)應(yīng)無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)方法常規(guī)法驗(yàn)證結(jié)果的回收率 (cfu/mL)

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法 根據(jù)常規(guī)法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，益氣通便顆粒對(duì)細(xì)菌有一定的抑制作用，采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)[5-6]。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法回收率為75%，大于70%，表明經(jīng)采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)能有效消除益氣通便顆粒對(duì)細(xì)菌的抑制作用，采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)測(cè)定應(yīng)可行。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 細(xì)菌、霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)方法培養(yǎng)基稀釋法驗(yàn)證結(jié)果的回收率 (cfu/mL)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，初步確定益氣通便顆粒細(xì)菌計(jì)數(shù)方法為培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法為常規(guī)法。

2.4.3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證[7]試驗(yàn)組：分別取上述供試液10mL、大腸埃希菌1mL接種到同一100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，移至35℃培養(yǎng)24h左右，取以上培養(yǎng)物0.2mL接種到5mLMUG培養(yǎng)基上，于366nm紫外燈下分別在5h、24h觀察熒光；然后進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)。另取培養(yǎng)物接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，至35℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落形態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

陰性對(duì)照組：取上述制好備用的金黃色葡萄球菌1mL接種到100mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，方法同試驗(yàn)組進(jìn)行檢查。

表3 控制菌的驗(yàn)證結(jié)果

結(jié)果表明按常規(guī)法檢查，益氣通便顆粒對(duì)大腸埃希菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，可采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌的檢查。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，益氣通便顆粒微生物限度檢查方法可為：

微生物限度：照微生物限度檢查法(中國(guó)藥典2010版一部附錄ⅩⅢC)取本品10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液稀釋至100mL，混勻，作為1∶10的供試液。

細(xì)菌數(shù)：取1∶10的供試液1mL注入5個(gè)平皿中，平行制備10個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定。

霉菌和酵母菌數(shù)：取1∶10的供試液1mL注入1平皿中，平行制備2平皿，按平皿法測(cè)定。

大腸埃希菌:取1∶10的供試液10mL加入100mL膽酸乳糖培養(yǎng)基中，低度法檢查。

細(xì)菌數(shù)每1g不得超過(guò)1 000cfu，霉菌和酵母菌數(shù)每1g不得超過(guò)100cfu，大腸埃希菌每1g不得檢出。

3 討論

益氣通便顆粒對(duì)細(xì)菌有一定的抑制作用，采用常規(guī)法不能有效消除益氣通便顆粒對(duì)細(xì)菌的抑制作用，需進(jìn)一步采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行驗(yàn)證；通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，本品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查可采用培養(yǎng)基稀釋法檢驗(yàn)，控制菌可采用常規(guī)法進(jìn)行檢驗(yàn)；另本品對(duì)大腸埃希菌無(wú)抑菌作用，故控制菌可采用常規(guī)法進(jìn)行檢驗(yàn)。通過(guò)以上微生物限度檢驗(yàn)方法的研究，建立了合理可行的檢驗(yàn)方法，為微生物限度檢測(cè)方法的建立提供了有利的依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：李嵐春)

Study on the Method of Microbial Limit Test of Yiqitongbian Grain

Wang Hongshui

(Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Stock Co.,LTD，Hubei 430064)

Objective:To establish the method of microbial limit test of Yiqitongbian grain.Methods:According to theChinaPharmacopoeia2010 Edition appendix of microbial limit test method test guideline,use the culture medium dilution method and the routine method to determine the microbial limits of Yiqitongbian grain.Results:The recovery of the strain rate was more than 70%,the experimental group were verified by test bacteria in the control bacterium of conventional method;by method validation indicated that bacteria,mil-dew and yeast inspection,medium dilution can be used to control bacteria,mildew and yeast′s inspection of bacteria test,the routine method can be used to check Controling bacteria.Conclusion:The established Yiqitongbian grain of microbial limit test method is accurate,reliable,feasible,and can carry out the measurement of microbial limit for its effective.

Yiqitongbian Grain; The Routine Method; Culture Medium Dilution Method; Method Validation

2014-01-21

王洪水(1971-)，男，湖北馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司工程師、執(zhí)業(yè)藥師，研究方向?yàn)橹兴幪崛　?/p>

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1673-2197(2014)08-0037-02