常 婧，周婭靜，石海燕，胡志勇

(中北大學(xué) 化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051)

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甘草總黃酮提取工藝優(yōu)化

常 婧，周婭靜，石海燕，胡志勇

(中北大學(xué) 化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051)

目的：采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化甘草總黃酮提取工藝。方法：以總黃酮含量為指標(biāo)，采用回流提取法，考察提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度和料液比對(duì)總黃酮得率的影響。結(jié)果：最終確定在提取溫度為80℃，乙醇-水比例為7∶3，料液比為1∶15的條件下回流提取1h是甘草總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)論：該工藝簡(jiǎn)單可行，操作簡(jiǎn)便，條件可控，是提取甘草總黃酮的有效途徑。

甘草；總黃酮；提取工藝

甘草為多年生草本豆科植物，新疆是我國(guó)野生甘草種類最多、蘊(yùn)藏量最豐富的地區(qū)之一[1]。近年來，很多學(xué)者對(duì)甘草的化學(xué)成分做了大量研究，已從甘草屬植物地上部分分離得到了59種黃酮類化合物和7種酚類成分，以異黃酮和二氫黃酮類最多[2]。甘草總黃酮可促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖[3]，發(fā)揮抗氧化、抗衰老、抗腫瘤作用[4]，對(duì)自由基有很好的清除作用，目前已作為抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。因此，提取分離具有較高生物活性的黃酮類化合物對(duì)醫(yī)藥工業(yè)有著十分重要的意義。本文利用回流法和三因素三水平的正交試驗(yàn)確定甘草中總黃酮的最佳提取工藝條件，為更好地利用甘草中的活性有效成分提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津UV1800紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA基團(tuán))；CPA224S型電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；DFT-100手提式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺大德中藥機(jī)械有限公司)。

1.2 材料

甘草藥材于2012年10月購自山西中醫(yī)學(xué)院，經(jīng)相關(guān)專家鑒定為甘草，在真空干燥器中干燥至恒重，備用。蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究院)，編號(hào)：100080-200707；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉和硝酸鋁均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 本實(shí)驗(yàn)采用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，因?yàn)樘J丁與甘草總黃酮的結(jié)構(gòu)類似。用電子天平精密稱取在120℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5mg，置于25mL容量瓶中，用乙醇∶水=6∶4的溶劑溶解并定容至25mL，得到濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取配置好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置于7個(gè)25mL容量瓶中，再分別加入60%乙醇溶液10、9.5、9、8、7、6、5mL，搖勻。

然后加入1mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻，擱置6min再加1mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻。反應(yīng)6min后加入1mL 4%氫氧化鈉溶液，再加60%乙醇定容，搖勻。15min后用紫外可見檢測(cè)器檢測(cè)其在510nm處的吸光度值。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程Y=16.412 5X-0.010 5，R2=0.999 8。

2.1.3 樣品溶液制備 準(zhǔn)確稱取干燥粉碎后的甘草10g，在設(shè)定的提取條件下采用索氏提取器回流提取，將得到的提取液旋蒸成膏狀后，放在60℃真空干燥箱中干燥至恒重，精密稱取干燥粉末20mg于10mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容。

2.1.4 總黃酮含量測(cè)定 按照“2.1.2”所示方法測(cè)定所得提取液的吸光度，利用所得的回歸方程計(jì)算總黃酮濃度，進(jìn)而可以得到總黃酮的得率，總黃酮的得率(%)=(總黃酮濃度×提取液體積)/對(duì)應(yīng)的原料重量×100%。以提取溫度、回流時(shí)間、乙醇濃度和料液比為考察因素，以總黃酮得率作為考察指標(biāo)，先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后選出影響較大的因素，再進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 在乙醇濃度60%～90%范圍內(nèi)，采用不同濃度的乙醇溶液回流提取甘草總黃酮，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著乙醇濃度的增加，黃酮得率先增加后減少，在乙醇濃度為70%時(shí)得率最高；超過70%后，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率開始下降。這可能是由于提取溶劑極性降低，使提取液中脂溶性成分增加，造成總黃酮含量相對(duì)下降。從總黃酮得率來看，提取溶劑乙醇的濃度應(yīng)設(shè)定為60%～80%。

2.2.2 回流時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 在1～3h范圍內(nèi)，設(shè)定不同的回流時(shí)間提取甘草總黃酮。結(jié)果表明回流時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響很小。當(dāng)提取時(shí)間超過1h時(shí)，隨著時(shí)間的增加，總黃酮得率無明顯變化，所以提取時(shí)間設(shè)定為1h。

2.2.3 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 在60～90℃范圍內(nèi)，設(shè)定不同的溫度提取甘草總黃酮，結(jié)果表明總黃酮得率隨著溫度的升高先增大后減少。當(dāng)達(dá)到80℃時(shí)，溫度再增加，總黃酮得率開始下降。這是因?yàn)樵谳^低濃度范圍內(nèi)，黃酮分子運(yùn)動(dòng)速度隨著溫度的升高而加快，有很強(qiáng)的滲透和擴(kuò)散性，有利于黃酮類化合物的提取；但當(dāng)溫度增加到80℃后，雜質(zhì)的溶出量也隨之增加，總黃酮相對(duì)含量降低，故選擇80℃作為提取溫度。

2.2.4 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 利用不同的料液比提取總黃酮，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明料液比小于1∶20時(shí)，得率基本沒有變化。因?yàn)楫?dāng)料液比相對(duì)較低時(shí)，在回流過程中溶劑內(nèi)提取物濃度過高，與原料濃度差小，不利于總黃酮的擴(kuò)散；但當(dāng)料液比增大到一定程度時(shí)，總黃酮得率會(huì)接近飽和狀態(tài)，從節(jié)省溶劑、降低成本的角度考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇的料液比為不高于1∶25。

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步確定甘草總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度為70%，提取溫度為80℃，回流時(shí)間為1h，料液比為1∶20，總黃酮得率可達(dá)到6.60%。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總黃酮得率受多種因素的影響，因此實(shí)驗(yàn)選定乙醇濃度、提取溫度和料液比進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)。采用L9(33)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定總黃酮的最佳工藝。因素水平安排見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

由正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，三個(gè)因素中對(duì)甘草總黃酮提取率影響最大的為溫度，其次為乙醇濃度，最小的為料液比。實(shí)驗(yàn)6號(hào)為提取甘草總黃酮的最佳工藝，即在80℃下，乙醇濃度為70%，料液比為1∶15的條件下提取回流1h，總黃酮得率可達(dá)到6.89%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

影響因素B的F>F0.05，即P<0.05，即提取溫度對(duì)甘草總黃酮得率的影響最為顯著，而乙醇濃度、料液比兩種因素對(duì)總黃酮得率均無顯著影響，方差分析結(jié)果見表3。

表2 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2, 2)=19。

3 結(jié)論

本研究采用索氏提取器提取甘草總黃酮，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果，確定甘草總黃酮的最佳提取工藝為在80℃、料液比為1∶15、乙醇濃度為70%的條件下回流提取1h。該提取工藝簡(jiǎn)單可行，條件易于控制，是提取甘草總黃酮的有效途徑，為今后更好地利用甘草資源提供了理論參考和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

[1] 王學(xué)農(nóng),馬彩雯.新疆甘草人工種植前景探討[J].新疆農(nóng)機(jī)化,2004(6):34-35.

[2] 梁冰,楊愛馥,黃鳳蘭,等.甘草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006, 37(1):115-119.

[3] 呂欣,付玉杰,王微,等.紫外分光光度法測(cè)定甘草黃酮含量[J].植物研究,2003,23(2): 192-194.

[4] 陳東軍,王磊,祖曉冬,等.大黃素的高效提取及其NMR結(jié)構(gòu)探索研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,26(2):126-129.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2014-01-14

常婧(1987-)，女，中北大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)工程。

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1673-2197(2014)08-0024-02