田興中，凌曉紅，李藝鋒，武佐元

(貴陽中醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心，貴州 貴陽550002)

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Morris水迷宮法探討化風(fēng)丹對(duì)大鼠空間記憶能力的影響

田興中，凌曉紅*，李藝鋒，武佐元

(貴陽中醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心，貴州 貴陽550002)

目的：比較萬勝化風(fēng)丹、廖元和堂化風(fēng)丹、氯化汞(HgCl2)和亞砷酸鈉(NaAsO2)對(duì)健康SD大鼠空間記憶能力的影響。方法：清潔級(jí)SD大鼠每天分別喂食萬勝化風(fēng)丹(420mg·kg-1，含汞10.9mg·kg-1，含砷8.8mg·kg-1)、廖元和堂化風(fēng)丹(420mg·kg-1，含汞10.9mg·kg-1，含砷8.8mg·kg-1)、HgCl-2(5mg·kg-1，含汞3.7g·kg-1)、NaAsO-2(5mg·kg-1，含砷2.9mg·kg-1)以及空白對(duì)照組，持續(xù)60天，使用Morris水迷宮(MWM)法檢測(cè)其空間學(xué)習(xí)能力。結(jié)果：用藥前大鼠潛伏期在第1～4天無明顯變化，訓(xùn)練第5天各組潛伏期顯著下降；用藥后訓(xùn)練第1～5天各組潛伏期呈明顯下降趨勢(shì)。與正常組比較，用藥前各組在第1～5天均無顯著差異，用藥后HgCl2組在第2～5天均有顯著性差異(P<0.05)，萬勝化風(fēng)丹組、廖元和堂化風(fēng)丹組及去NaAsO2組僅在第4天差異顯著(P<0.05)；與HgCl2組比較，用藥前各組在第1～5天均無顯著差異，用藥后萬勝化風(fēng)丹組、廖元和堂化風(fēng)丹組和NaAsO2組在第2～5天均差異顯著(P<0.05)。結(jié)論：HgCl2長(zhǎng)期應(yīng)用可顯著降低大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的空間記憶能力，化風(fēng)丹對(duì)此無明顯影響。

萬勝化風(fēng)丹；廖元和堂化風(fēng)丹；HgCl2；NaAsO2；Morris水迷宮

化風(fēng)丹是受國務(wù)院保護(hù)的四大名藥之一，由藥母、麝香、天麻、僵蠶、全蝎、雄黃、朱砂等15味名貴中藥材配伍經(jīng)過獨(dú)特的下窖發(fā)酵及風(fēng)干工藝制作而成，主治風(fēng)痰閉阻(頭痛、耳鳴、腦動(dòng)脈硬化、肢體麻木無力及腦萎縮)、癲癇、中風(fēng)偏癱、面神經(jīng)麻痹等，是世界上生產(chǎn)及銷售時(shí)間最長(zhǎng)的治療腦部疾病的中成藥?；L(fēng)丹中含礦物藥朱砂和雄黃，是其治療腦部疾病產(chǎn)生藥理作用的重要成分[1]。然而，朱砂、雄黃各自的主要成分HgS、α-As4S4是國際公認(rèn)毒物汞、砷元素的化合物，其安全性問題深受國內(nèi)外關(guān)注。由化風(fēng)丹主治病癥可知，神經(jīng)系統(tǒng)是其發(fā)揮藥效的重要靶器官，對(duì)于這方面的研究，目前少有相關(guān)報(bào)道。本研究從長(zhǎng)期用藥角度，給予大鼠喂食臨床等效劑量萬勝化風(fēng)丹、廖元和堂化風(fēng)丹和去朱砂化風(fēng)丹60天，觀察其與HgCl2、NaAsO2對(duì)大鼠空間記憶能力影響的異同。

Morris水迷宮(MWM)是英國心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)的，用于研究實(shí)驗(yàn)室大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力以及評(píng)價(jià)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、藥物作用之間的關(guān)系的裝置，在當(dāng)代神經(jīng)科學(xué)研究中占據(jù)十分重要的位置[2-3]。目前，有相當(dāng)多的試驗(yàn)者利用水迷宮來評(píng)價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)與記憶能力[4]，最常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)是定位航行實(shí)驗(yàn)的“逃避潛伏期”[5]。另外，我們采用每天第1次訓(xùn)練的成績(jī)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，這樣反映出的是大鼠對(duì)前一天的記憶力[6]。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康清潔級(jí)SD大鼠，雄性，160～200g，清潔級(jí)，購自重慶滕鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(渝)2007-0005。大鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)性常規(guī)喂養(yǎng)3d，保證大鼠每天充足的飼料和飲水，光照12h。篩選出達(dá)到學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)的大鼠30只，將其隨機(jī)分為5組(n=6)為萬勝化風(fēng)丹組(萬勝組)、廖元和堂化風(fēng)丹組(廖元和堂組)、HgCl2組、NaAsO2組和對(duì)照組。

1.2 主要藥品

廖元和堂化風(fēng)丹購自貴州廖元和堂藥業(yè)公司，批號(hào)120315；萬勝化風(fēng)丹購自貴陽萬勝藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)120307；HgCl2購自貴州省萬山特區(qū)礦產(chǎn)公司，批號(hào)1110003；NaAsO2購自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào)20130301。

1.3 主要儀器

Morris水迷宮由不銹鋼水池(圓柱狀)、可移動(dòng)平臺(tái)和圖像自動(dòng)采集、處理系統(tǒng)等組成。水池直徑150cm，高70cm；平臺(tái)直徑15cm，高40cm；水池四個(gè)象限有不同符號(hào)的導(dǎo)航標(biāo)識(shí)。

1.4 定位航行試驗(yàn)

定位航行實(shí)驗(yàn)是通過大鼠在水中尋找平臺(tái)的逃避潛伏期來檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)能力的，方法如下：(1)將大鼠頭朝池壁放入水中，放入位置取第二象限起始位置。記錄動(dòng)物找到水下平臺(tái)的時(shí)間(s)，即逃逸潛伏期。在前幾次訓(xùn)練中，如果這個(gè)時(shí)間超過90s，則引導(dǎo)動(dòng)物到平臺(tái)，在平臺(tái)上停留30s。(2)將大鼠移開，放在150W的白熾燈下5min，放回籠內(nèi)。1只動(dòng)物每天訓(xùn)練2次，上午、下午各1次，連續(xù)訓(xùn)練5d，并記錄訓(xùn)練成績(jī)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

各給藥組大鼠每日食量、飲水量以及排便均未發(fā)現(xiàn)異常，毛色柔順有光澤，體重穩(wěn)定上升，各給藥組無顯著性差異，實(shí)驗(yàn)過程中無死亡。

2.2 定位航行試驗(yàn)

用藥前大鼠潛伏期在第1天至第4天無明顯變化，訓(xùn)練第5天各組潛伏期顯著下降；用藥后訓(xùn)練第1～5天各組潛伏期呈明顯的下降趨勢(shì)，且萬勝化風(fēng)丹組、廖元和堂化風(fēng)丹組、NaAsO2組以及正常組在第2～5天與用藥前比較均具有顯著性差異(P<0.05) (見表2～5)，HgCl2組僅在第4天與用藥前比較有顯著性差異(P<0.05) (見表4)；與正常組比較，用藥前各組在第1～5天均無顯著差異，用藥后HgCl2組在第2～5天均有顯著性差異(P<0.05) (見表2～5)，萬勝化風(fēng)丹組、廖元和堂化風(fēng)丹組和NaAsO2僅在第4天差異顯著(P<0.05) (見表4)；與HgCl2組比較，用藥前各組在第1～5天均無顯著差異，用藥后萬勝化風(fēng)丹組、廖元和堂化風(fēng)丹組和NaAsO2組在第2～5天均差異顯著(P<0.05) (見表2～5)。

表1 大鼠第1天逃避潛伏期結(jié)果

與給藥前比較aP<0.05; 與正常組比較bP<0.05; 與HgCl2組比較cP<0.05。

表2 大鼠第2天逃避潛伏期結(jié)果

與給藥前比較aP<0.05; 與正常組比較bP<0.05; 與HgCl2組比較cP<0.05。

表3 大鼠第3天逃避潛伏期結(jié)果

與給藥前比較aP<0.05; 與正常組比較bP<0.05; 與HgCl2組比較cP<0.05。

表4 大鼠第4天逃避潛伏期結(jié)果

與給藥前比較aP<0.05; 與正常組比較bP<0.05; 與HgCl2組比較cP<0.05。

表5 大鼠第5天逃避潛伏期結(jié)果

與給藥前比較aP<0.05; 與正常組比較bP<0.05; 與HgCl2組比較cP<0.05。

3 討論

用藥前，各組大鼠每天訓(xùn)練的潛伏期無顯著差異，即各組大鼠在用藥前的空間記憶能力相當(dāng)，表明篩選方式是正確且成功的，這為后期實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3.1 大鼠用藥前后每天訓(xùn)練結(jié)果差異討論

與用藥前訓(xùn)練成績(jī)比較，用藥后各組大鼠的潛伏期均有明顯的下降趨勢(shì)，表明大鼠在喂養(yǎng)60天后，經(jīng)過1天的適應(yīng)性訓(xùn)練，對(duì)給藥前的訓(xùn)練結(jié)果具備一定程度的遠(yuǎn)期記憶能力。而HgCl2組大鼠的這一能力與其他組比較并不顯著，從這一角度來看，HgCl2的長(zhǎng)期應(yīng)用減弱了大鼠的空間記憶能力。

3.2 大鼠用藥后每天各組訓(xùn)練結(jié)果差異討論

用藥后，正常組大鼠每天訓(xùn)練的潛伏期呈顯著下降趨勢(shì)，萬勝組、廖元和堂組和NaAsO2組與正常組的趨勢(shì)相同，且無顯著性差異，表明兩種化風(fēng)丹和NaAsO2對(duì)大鼠空間記憶能力無明顯影響。而HgCl2組在第2～5天的潛伏期均顯著高于正常組及其他給藥組，提示HgCl2的長(zhǎng)期應(yīng)用可減弱大鼠的空間記憶能力。

綜上所述，HgCl2的長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的空間記憶能力具有顯著的影響，這主是由于HgCl2是無機(jī)汞，與朱砂中主要成分HgS存在形式不同，導(dǎo)致其對(duì)腦組織的不同影響。

[1] ZHANG F,LU YF,WU Q,et al．Role of cinnabar and realgar of WSHFD in protecting against LPS-induced neurotoxicity[J]．Journal of Ethnopharmacology, 2012，139 (3): 822-828.

[2] VASCONCELLOS AP,ZUGNO AI,DOS SANTOS AH．Na+, K+-ATPase activity is reduced in hippocampus of rats submitted to an experimental model of depression: effect of chronic lithium treatment and possible involvement in learning deficits[ J]．Neurobiol Learn Mem, 2005, 84(2): 102-110.

[3] CHOEIRI C,HEWITT K,DURKIN J．Longitudinal evaluation of memory performance and peripheral neuropathy in the Ins2C96YAkita mice[J]．Behav Brain Res, 2005, 157(1): 31-38.

[4] BRANDEIS R,BRANDYS R,YEHUDA S.The use of the Morris water maze in the study of memory and learning[ J]．Neuroscience,1989, 48(1-2): 29-69.

[5] 陳羅西，郭玲玲，李亮．Morris 圓形水迷宮的應(yīng)用及其相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)分析[J]．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10( 8) : 55．

[6] 羅小泉，駱利平，陳海芳，等．Morris 水迷宮檢測(cè)大鼠記憶力方法的探討[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010,21(10):2667-2669.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

2014-01-17

田興中，貴陽中醫(yī)學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚砑岸纠韺W(xué)。

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1673-2197(2014)08-0012-02