文 一，郜志云，白 輝，朱崗輝

環(huán)境保護(hù)部環(huán)境規(guī)劃院，北京100012

地下水是可利用水資源的重要組成部分，全球三分之一的淡水資源來自于地下水，也是許多國家的主要飲水來源［1］。隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展，地下水環(huán)境面臨越來越多的威脅，病原微生物成為影響地下水環(huán)境的重要污染物［2］。以地下水為媒介傳播疾病的微生物主要包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲，能引發(fā)霍亂、傷寒、傳染性肝炎、鉤端螺旋體等疾病，會造成大規(guī)模傳染病的暴發(fā)［3］。在發(fā)展中國家，約80%的疾病是由水生病原菌引起的，這些疾病造成每天約27 000人死亡［4］;在美國，每年估計有590萬人因暴露地下水病原菌而致病，造成9 400 人死亡［5］。

隨著人口增長和土地利用擴(kuò)展，病原菌污染源增加，增加了地下水污染的可能性，因此開展地下水中病原菌監(jiān)測是保障飲水安全，保護(hù)人群健康的重要前提。目前中國地下水中病原菌的檢測方法主要為傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法［6］，該方法存在操作繁瑣、檢測時間長、部分病原菌難以檢測等問題，難以滿足當(dāng)前地下水環(huán)境管理對檢測技術(shù)的需求。核酸擴(kuò)增、生物芯片及生物傳感器等檢測技術(shù)是當(dāng)前重要的水體病原菌檢測手段。發(fā)展快速、精確的病原菌檢測技術(shù)是世界各國研發(fā)的熱點(diǎn)，該文對近年來國際上出現(xiàn)的地下水病原菌檢測技術(shù)進(jìn)行簡要的介紹，以期為地下水中病原菌的有效監(jiān)測和控制提供技術(shù)支持。

1 地下水中的病原菌

地下水中的病原菌微生物一般來自人與動物的排泄物，特別是糞便，其污染源有發(fā)生滲/泄漏的垃圾填埋場、畜禽養(yǎng)殖場、污水處理廠和接納生活和畜禽污水的地表水體［7］，通過土壤淋濾和地表水-地下水水力交換進(jìn)入到地下水中。

地下水常見的污染致病菌主要為腸道菌如大腸桿菌(Escherichia Coli)、沙門氏菌(Salmonella)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter)及水生細(xì)菌如嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)等多種細(xì)菌，詳見表 1［8-13］。

大多數(shù)通過人或動物的糞便進(jìn)入水體的水源性病原菌不能在水中生長，但某些病原菌，如軍團(tuán)菌、非典型分支桿菌、類鼻疽伯克氏菌是環(huán)境微生物，可在水體或土壤中生長，增加人群暴露風(fēng)險。除攝入途徑外，有些病原菌還可通過吸入和皮膚接觸暴露于人群，如軍團(tuán)菌和非典型分支桿菌可通過吸入途徑引起呼吸道感染，類鼻疽伯克氏菌則可通過接觸傳播引起接觸部位的感染。大部分病原菌可引起腹瀉、嘔吐、發(fā)熱、頭痛等輕微癥狀，少部分強(qiáng)致病菌在較低感染濃度下可引起嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病甚至死亡。

表1 地下水中常見病原菌

2 病原菌遷移轉(zhuǎn)化

病原菌在地下水中的遷移轉(zhuǎn)化受到表層土壤和包氣帶厚度、地質(zhì)構(gòu)造、水文地質(zhì)狀況和污染源類型的影響，見表2［14］。土壤和包氣帶通過過濾和吸附作用阻止病原菌向地下水中遷移。土壤粒徑分布是影響過濾效果的重要因素，粒徑越小，效果越好，因?yàn)榧?xì)顆粒物的死端孔隙能有效過濾病原菌;吸附作用受到包氣帶疏水性、土壤和沉積物濕度、pH、離子強(qiáng)度的影響。相比于含水層，表層土壤和包氣帶具有更強(qiáng)的使病原菌衰減的能力，Schijven研究結(jié)果表明，在沙丘中傳染性病毒用25 d從污染源遷移了30 m，病毒數(shù)量減少了8個數(shù)量級，在該場地的含水層中，要降低到相同的數(shù)量需要遷移 40 d［15］。

表2 地下水中影響病原菌遷移的因素

病原菌進(jìn)入含水層后，含水層孔隙度和水流速度是影響病原菌衰減和遷移的重要因素?？紫?、巖溶和裂隙地下水具有不同的流速，對病原菌的衰減程度各不相同［16］，在孔隙地下水中，地下水流速為每天十幾米，病原菌不容易遷移，易發(fā)生衰減;在巖溶水中，由于較大的水流速度，病原菌可以每天遷移數(shù)公里，因此裸露的巖溶含水層易受病原菌的污染。大量結(jié)果表明，水源性疾病容易在非孔隙型地下水中爆發(fā)，特別是在基巖裂隙或者巖溶地下水中發(fā)生［17］。因此，應(yīng)重視巖溶和裂隙地下水等環(huán)境敏感地區(qū)的地下水病原菌污染的監(jiān)測工作。

3 地下水中病原菌檢測現(xiàn)狀

目前大多數(shù)國家和地區(qū)仍采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對環(huán)境中病原菌進(jìn)行檢測。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得檢測結(jié)果的成本和時限問題，對于地下水中特殊病原菌的檢測，目前一般僅限于確認(rèn)是否污染或確證某種水處理工藝的有效性，而對于微生物的監(jiān)測通常僅限于指示性微生物，如用總大腸菌群監(jiān)測水處理效果，用埃希氏大腸桿菌指示水體是否被糞便污染。然而多數(shù)病原菌的存在條件與指示微生物的存在條件不是完全相關(guān)的，用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法很難直接反映其污染情況，因此僅檢測一種或少數(shù)幾種病原菌的濃度并不能反映病原菌的污染情況，如流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明總大腸菌數(shù)，糞大腸菌數(shù)等指示微生物與霍亂弧菌、志賀氏菌等引起的病理學(xué)發(fā)病率的相關(guān)性較差，這些情況都說明傳統(tǒng)的檢測方法已經(jīng)過時，很難起到監(jiān)測水體環(huán)境質(zhì)量的作用［18］。

4 影響地下水中病原菌檢測的因素

對地下水中病原菌檢測影響因素的了解，是研發(fā)有針對性檢測技術(shù)的基礎(chǔ)。影響地下水中病原菌的檢測因素主要包括以下3個方面：1)水體體積較大，水體中微生物濃度相對較低，很難直接從大量水中分離或檢測到少量的特定病原菌［19］;2)水體中營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，病原菌污染水體并經(jīng)長時間的適應(yīng)后易形成存活但不可培養(yǎng)的狀態(tài)［20］;3)隨著人類活動的增加，病原菌污染水體的機(jī)會也相應(yīng)增加，這也相應(yīng)提高了對水體中病原菌監(jiān)測的種類、場所及頻次等要求。因此，快速、高通量、準(zhǔn)確特異性是水體病原菌檢測技術(shù)研究中需考慮的重要因素。

5 不同病原菌檢測方法在地下水中的應(yīng)用現(xiàn)狀

病原菌檢測技術(shù)主要分為以下幾大類：傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)、生物芯片法(biochip)、生物傳感器(biosensor)等方法，如表3所示。平板培養(yǎng)法檢測所需周期長，很多病原菌檢測方法還未建立，更重要的是許多微生物不能在固體培養(yǎng)基上形成菌落，環(huán)境中物理或化學(xué)等因素也易影響病原菌的活性而形成不可培養(yǎng)狀態(tài)，影響對水體病原微生物及時和有效的監(jiān)測［21-22］。免疫學(xué)方法檢測病原菌的假陽性或假陰性率較高，不能反映水體中病原菌實(shí)際污染情況。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、生物芯片法、生物傳感器等生物和生物物理方法，因?yàn)槠淇焖凫`敏、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)被廣泛關(guān)注。下面對上述3類新技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)介紹。

表3 地下水中病原菌主要檢測技術(shù)

5.1 聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)技術(shù)在地下水中的應(yīng)用現(xiàn)狀

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是針對目的基因設(shè)計特異寡核苷酸引物，并在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶和4種dNTP，以目的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行多個循環(huán)的DNA體外擴(kuò)增的技術(shù)，在短時間內(nèi)可通過擴(kuò)增獲得大量目的基因。PCR及其衍生的方法，如實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，已用于檢測或鑒別不同類型水體中的一種或多種病原菌［23-24］，但單獨(dú)使用上述方法不能區(qū)分活菌和死菌，易造成假陽性，研究發(fā)現(xiàn)在熒光定量PCR或基因芯片等核酸擴(kuò)增技術(shù)中利用疊氮溴化丙錠(propidium monoazide)，可選擇性結(jié)合修飾死菌細(xì)胞的DNA，從而間接計算出水體樣本中活菌數(shù)量，提高PCR技術(shù)的檢測準(zhǔn)確度［25-26］。另外由于病原菌在水體中的濃度較低，可通過較長時間的前增菌或濃縮處理，增加目標(biāo)活菌的濃度，稀釋干擾雜質(zhì)，復(fù)蘇受損細(xì)菌［27-29］，提高檢測的準(zhǔn)確性。為了避免長時間的增菌或濃縮步驟，He等［30］采用免疫磁珠(IMS)直接從水樣中特異性捕獲產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC)。微生物的rRNA(pre-rRNA)是一種反映系統(tǒng)發(fā)育特性和指示生理狀態(tài)的總rRNA的重要成分，Cangelosi等［31］通過反轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析pre-rRNA的變化情況達(dá)到檢測活病原菌的目的。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(Lamp)是一種比PCR技術(shù)更靈敏，速度更快的核酸擴(kuò)增技術(shù)，依賴于能夠識別靶DNA上6個特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，1 h即可完成。Yamazaki等［32］用 Lamp檢測產(chǎn)霍亂毒素的霍亂弧菌，大大縮短了檢測時間，靈敏度提高10倍。為了改善Lamp的應(yīng)用性，Chang等［33］將病原菌DNA磁珠提取組件及微流控LAMP反應(yīng)芯片和光學(xué)檢測系統(tǒng)整合成一臺可快速、靈敏、方便的裝置，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中水體中病原菌的檢測。

5.2 生物芯片技術(shù)在地下水中的應(yīng)用現(xiàn)狀

生物芯片技術(shù)是采用原位合成或微矩陣點(diǎn)樣等方法將大量的生物分子有序地固定在硅膠片等固化材料上，然后與已標(biāo)記的待測樣品進(jìn)行作用，通過特定的儀器分析相應(yīng)的作用情況而達(dá)到分析檢測的目的。根據(jù)生物芯片所選用固化材料的不同，可將生物芯片分為基因芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片及組織芯片等，各種生物芯片檢測技術(shù)均具有檢測通量和自動化程度高的特點(diǎn)，目前對水中病原菌檢測應(yīng)用較多的主要是基因芯片和微流控芯片。Zhou［34］等針對細(xì)菌的16S-23S rRNA 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和促旋酶B基因序列設(shè)計寡核苷酸基因芯片，可同時檢測水體中包括肺炎軍團(tuán)菌、沙門氏菌、致賀氏菌、腸炎耶爾森菌及霍亂弧菌等28種致病菌，重復(fù)性和特異性較好，在飲用水中添加陽性細(xì)菌后檢測靈敏度最低可至0.1 ng DNA或104CFU/mL。微流控芯片(Microfluidic lab-on-a-chip)具有比表面積大、樣品需要量小及檢測通量高等多種優(yōu)點(diǎn)，Agrawal等［35］將其同免疫磁納米粒子及碲化鎘量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合可快速靈敏地同時檢測水中低濃度的大腸桿菌和沙門氏菌。Cichova等［36］在研究水中病原菌的檢測過程中，應(yīng)用微電化學(xué)技術(shù)開發(fā)了一種微流控生物芯片，可在線裂解病原菌并提取核酸，從而有利于后續(xù)的快速檢測。Dharmasiri等［37］用O157多克隆抗體共價耦聯(lián)修飾微流控芯片后，可快速富集水體中較低濃度(＜100細(xì)胞/毫升)的E．coli O157：H7，然后將富集的菌體使用實(shí)時熒光定量PCR針對slt1基因擴(kuò)增檢測，結(jié)果表明，該方法的回收率可達(dá)到72%，檢出限最低達(dá)到6 CFU/L。Liu等［38］用低蛋白結(jié)合膜獲得菌體，然后直接提取RNA并進(jìn)行RT-PCR后，利用芯片檢測E．coli O157：H7的rfbE和fliC基因，該方法最低可檢測到自來水中的3～4 CFU/L的E．coli O157：H7，河水中最低可檢測7 CFU/L的E．coli O157：H7。

5.3 生物傳感器檢測技術(shù)在地下水中的應(yīng)用現(xiàn)狀

生物傳感器起源于20世紀(jì)60年代，是將生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件緊密結(jié)合，從而檢測目標(biāo)物的分析裝置。不同的生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件組成了不同的生物傳感器，分類方式有多種，可根據(jù)生物識別元件或信號轉(zhuǎn)換元件分。轉(zhuǎn)化元件，目前的生物傳感器主要包括電化學(xué)生物傳感器、電流生物傳感器、電位生物傳感器、阻抗生物傳感器、光學(xué)生物傳感器和壓電生物傳感器等，目前在致病菌檢測方面研究較多的是電化學(xué)生物傳感器、光學(xué)生物傳感器和壓電生物傳感器［39］。Simpson 等［40］直接利用光纖可視生物傳感器在2 h內(nèi)快速檢測水體中的大腸桿菌，不但降低了基質(zhì)中的PCR反應(yīng)抑制劑，還減少了對樣品進(jìn)行前增菌處理過程，提高了檢測速度。Chowdhury等［41］用基于共價連接在電極上多聚苯胺膜的抗原抗體反應(yīng)制成的阻抗生物傳感器檢測水中的E．coliO157：H7。目前，用于水中致病菌檢測的生物傳感器種類很多，也有不少商品化的儀器問世，但其檢測限還偏高，在實(shí)際檢測中易出現(xiàn)假陽性、假陰性的結(jié)果。未來生物傳感器的發(fā)展趨勢和重點(diǎn)方向是微型化、多功能化、智能化和集成化，開發(fā)新一代低成本、高靈敏度、高穩(wěn)定性和高壽命的生物傳感器是目前研究的熱點(diǎn)。

6 討論

目前，中國對于水體中病原菌等微生物的檢測種類相對于水體中日益增多的病原菌污染仍然比較少，主要限于菌落總數(shù)、大腸菌群和軍團(tuán)菌等。另外，檢測手段也比較落后，主要包括微生物的分離純化，生化鑒定、血清學(xué)鑒定、酶學(xué)鑒定等常規(guī)方法或普通PCR鑒定。隨著分子生物學(xué)、物理、電子、材料等多種學(xué)科的發(fā)展，病原菌的檢測手段也日益豐富，熒光定量PCR、生物芯片或生物傳感器等技術(shù)手段得到廣泛的研究和發(fā)展，水體中病原菌檢測的準(zhǔn)確性、檢測速度、特異性和靈敏度都得到了極大的改善和提高。對于水中病原菌的檢測，除了以上幾種主要技術(shù)外還有幾種技術(shù)值得研究。如Fan等［42］應(yīng)用表面增強(qiáng)拉曼光譜結(jié)合納米技術(shù)檢測水中的多種致病菌，研究表明該技術(shù)有望進(jìn)行快速靈敏的檢測。Hunter等［43］應(yīng)用死端超濾濃縮水中E．coli O157：H7后，可有效進(jìn)行IMS/ATP(免疫磁珠捕獲－ATP)的活菌檢測。Keserue等［44］利用流式細(xì)胞儀結(jié)合膜濃縮技術(shù)、免疫磁珠分離技術(shù)研究對嗜肺軍團(tuán)菌的快速檢測，靈敏度高，而且可識別細(xì)菌的不同狀態(tài)。然而上述這些技術(shù)手段在中國還沒得到有效應(yīng)用，主要原因是這些檢測技術(shù)的研究主要集中在對分離純化好的病原菌的檢測階段，病原菌的前增菌和分離純化仍然是這些檢測技術(shù)難以突破的技術(shù)瓶頸，另外，這些技術(shù)的成本昂貴也是難以在實(shí)際監(jiān)測中得到廣泛應(yīng)用的因素。

7 展望

各種致病菌檢測技術(shù)各有所長，也有各自的缺陷。綜上所述，目前病原菌檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢是將PCR、生物芯片等檢測技術(shù)同微流控分離、免疫磁珠分離、納米材料標(biāo)記等結(jié)合，利用不同技術(shù)的優(yōu)勢，達(dá)到快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)、便攜甚至在線監(jiān)測的目的。因此，未來對地下水中病原菌的檢測技術(shù)還要更多考慮多種技術(shù)平臺或手段的整合，同時兼顧成本和實(shí)用性，以期為保障人類健康和飲用水安全提供更強(qiáng)有力的支撐。

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