梁寶東，魏海香 *，劉 靜，楊永濤，李 俏，牛漢剛

（1.濟(jì)寧學(xué)院 生命科學(xué)與工程系，山東 曲阜 273155；2.西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

菱角（Trapa bicornis）又名水栗、菱實(shí)，是一年生草本水生植物菱的果實(shí)[1]。菱角味甘、性寒，無(wú)毒，含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、葡萄糖、不飽和脂肪酸、多種維生素及人體必需的氨基酸，礦物質(zhì)元素和黃酮類化合物含量也較高。黃酮類化合物能有效改善腦血管功能和血液循環(huán)，對(duì)防治高血壓、動(dòng)脈硬化、心血管系統(tǒng)疾病有顯著的療效[2]。天然、營(yíng)養(yǎng)、保健的菱角啤酒具有很大的開發(fā)利用價(jià)值和良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[3]。本實(shí)驗(yàn)在先前初步研究的菱角啤酒的基礎(chǔ)上[4]，為降低菱角啤酒的酒精度，更加適應(yīng)市場(chǎng)的需要，進(jìn)一步研究其發(fā)酵條件，為菱角保健啤酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）APV：鄭州雅大集團(tuán)有限公司；菱角：市售；啤酒花：煙臺(tái)杰諾生物酶有限公司；大麥芽：曲阜三孔金豐麥芽有限公司；α-淀粉酶、糖化酶：棗莊杰諾生物酶有限公司；CaCl2（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；3,5-二硝基水楊酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；BL-100高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市松青五金工具廠；TDL-60B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；FA2004N電子分析天平：上海精密儀器有限公司；LY-0.2A/200啤酒釀制設(shè)備：山東良友設(shè)備有限公司；FCD-2000智能型恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上?，槴\試驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-25pH計(jì)：上海精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菱角啤酒制備工藝流程[4]

1.3.2 工藝操作要點(diǎn)

菱角汁的制備：用干磨機(jī)將脫殼干菱角粉碎，過(guò)300目篩，配成質(zhì)量濃度為20%的菱角粉漿，加入0.2%的CaCl2作為保護(hù)劑，用乳酸調(diào)整pH值為6.0，以30 U/g干物質(zhì)加入耐高溫α-淀粉酶，在95 ℃液化80 min。液化結(jié)束，冷卻至60 ℃，用乳酸調(diào)整pH值為5.0，以150 U/g干物質(zhì)加入糖化酶，60 ℃糖化2.5 h。菱角汁在85 ℃條件下保持10 min滅酶?？焖贋V紙進(jìn)行過(guò)濾，得到澄清的菱角汁。

麥芽汁的制備[5-7]：大米與麥芽按1∶3配料。將大米粉碎，過(guò)40目篩，細(xì)粉超過(guò)其質(zhì)量的70%，按1∶5加水，45 ℃保持10 min，升溫至90 ℃保持20 min，煮沸20 min，備用。麥芽粉碎，皮殼破而不爛，37 ℃保持20 min，升溫至50 ℃保持60 min后升溫至65 ℃，加入大米液糖化至碘液反應(yīng)完全，升溫至78 ℃，過(guò)濾。調(diào)整麥芽汁濃度為12°Bx，用乳酸調(diào)整pH值為5.2～5.4。麥汁煮沸過(guò)程中添加酒花0.08%，煮沸時(shí)間為90 min，過(guò)濾。

發(fā)酵：采用低溫發(fā)酵工藝[8-9]，按照試驗(yàn)方案，將麥芽汁和菱角汁加入發(fā)酵罐，接種酵母泥，進(jìn)行主發(fā)酵和后酵，在發(fā)酵過(guò)程中，定時(shí)取樣，測(cè)量相關(guān)工藝參數(shù)變化[10]。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測(cè)

氨基酸態(tài)氮測(cè)定采用甲醛滴定法[11]；pH值測(cè)定采用pH計(jì)；酒精度測(cè)定采用密度瓶法；糖度、原麥汁濃度采用密度瓶法；苦味值采用比色法；泡持性測(cè)定采用秒表法；雙乙酰測(cè)定采用紫外分光光度法[12]；酵母菌數(shù)測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)[13]；還原糖含量測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法[14-15]。

1.3.4 菱角啤酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

菱角啤酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（滿分100分）見表1。

表1 菱角啤酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of water chestnut beer

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌接種量對(duì)菱角啤酒酒精度和還原糖含量的影響

設(shè)置酵母菌的接種量為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，菱角汁的添加量為20%，主酵時(shí)間6 d，主酵溫度10 ℃，后酵時(shí)間13 d，后酵溫度4 ℃。檢測(cè)發(fā)酵液中還原糖下降曲線和酒精度的變化趨勢(shì)，結(jié)果見圖1，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

由圖1可知，發(fā)酵液的還原糖降低速率隨酵母菌接種量的增加而增加，酒精度隨接種量的增加而增加，當(dāng)酵母菌的接種量為0.1%時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)呛枯^高，酒精度偏低；當(dāng)酵母菌的接種量為0.9%時(shí)，還原糖下降速率快，發(fā)酵的高泡期提前，當(dāng)酵母菌的接種量為0.5%時(shí)，殘?zhí)呛亢途凭榷急容^適中。主酵2～3 d時(shí)泡沫最豐富，主酵第4天還原糖含量就達(dá)到后酵要求的4.5 g/100 mL左右，后酵時(shí)酵母菌數(shù)≥7×106CFU/mL，有利于啤酒的成熟[8]。

主酵后期酵母菌提前沉降，影響后期還原糖的繼續(xù)發(fā)酵。在感官評(píng)定方面，酵母添加量為0.1%時(shí)，有明顯的甜味，口感不清爽；酵母添加量為0.9%時(shí)，啤酒缺少醇厚感，口味較淡薄，啤酒殺口力差。接種量為0.5%時(shí)，口味較柔和，殺口力強(qiáng)。綜合理化指標(biāo)和感官評(píng)定，酵母菌的接種量為0.5%時(shí)菱角啤酒的發(fā)酵條件最佳。

2.2 菱角汁添加量對(duì)菱角啤酒酒精度和還原糖的影響

設(shè)置菱角汁的添加量為10%、15%、20%、25%、30%，酵母菌的添加量為0.5%，主酵時(shí)間6 d，主酵溫度10 ℃，后酵時(shí)間13 d，后酵溫度4 ℃。檢測(cè)發(fā)酵液中還原糖和酒精度的變化曲線，結(jié)果見圖2，并對(duì)啤酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

圖2 菱角汁添加量對(duì)菱角啤酒還原糖含量（A）和酒精度變化（B）的影響Fig.2 Effect of water chestnut juice addition on reducing sugar content (A) and alcohol content (B) in water chestnut beer

由圖2可知，菱角汁添加量越大，發(fā)酵初期發(fā)酵液糖度越低，且菱角汁的添加能降低發(fā)酵過(guò)程中的還原糖降低速率。在相同時(shí)間段，菱角汁添加量越大，酒精度越低，影響酵母菌的乙醇代謝。當(dāng)菱角汁的添加量為15%～20%，進(jìn)入后酵時(shí)，發(fā)酵液的還原糖含量在4.5 g/100 mL左右，酒精度在1.54%vol～1.90%vol。菱角汁添加量≥20%時(shí)，還原糖下降速率慢，酒精度較低，影響啤酒的品質(zhì)。

在感官評(píng)定方面，菱角汁添加量越大，泡沫越豐富，啤酒的苦味越重。不添加菱角汁的啤酒，入口清香，持久性較差；菱角汁添加量為10%～15%，菱角啤酒苦味較淡，清澈透明，無(wú)沉淀物；菱角汁添加量為20%，菱角啤酒的苦味適宜，爽口，口感醇厚，在口中的持久力強(qiáng)；菱角汁添加量為25%～30%，菱角啤酒苦味較重，口感差，沉淀物較多。綜合理化指標(biāo)和感官評(píng)定，菱角汁的添加量為20%時(shí)菱角啤酒的發(fā)酵條件最佳。

2.3 主酵時(shí)間對(duì)菱角啤酒還原糖和酒精度的影響

設(shè)置主酵時(shí)間為4 d、5 d、6 d、7 d、8 d，酵母菌添加量為0.5%，菱角汁添加量為20%，主酵溫度10 ℃，后酵時(shí)間13 d，后酵溫度4 ℃。檢測(cè)發(fā)酵液中還原糖和酒精度的變化曲線，并對(duì)啤酒進(jìn)行感官鑒定，確定最佳主酵時(shí)間。在此過(guò)程中，控制酵母接種的時(shí)間不同，主酵時(shí)間長(zhǎng)的提前接種，使它們同時(shí)進(jìn)入后酵。不同主酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中還原糖和酒精度變化的影響見圖3。

圖3 主酵時(shí)間對(duì)菱角啤酒還原糖含量和酒精度的影響Fig.3 Effect of main fermentation time on reducing sugar and alcohol content in water chestnut beer

由圖3可知，啤酒在發(fā)酵過(guò)程中，接種12 h后進(jìn)入發(fā)酵的低泡期，發(fā)酵液開始產(chǎn)生泡沫，還原糖降低速率較慢。3～4 d為發(fā)酵高泡期，泡沫豐富，糖降低速率快。主發(fā)酵第5天進(jìn)入落泡期，糖降速率有所降低，當(dāng)還原糖含量降到4.5 g/100 mL時(shí)，降溫進(jìn)入后酵，減緩酵母菌的沉降速率。當(dāng)主酵時(shí)間到第6天時(shí)，還原糖含量＜4.5 g/100 mL，此時(shí)進(jìn)入后酵，減緩酵母菌沉降的速率，有利于糖的進(jìn)一步分解和雙乙酰的還原。主酵時(shí)間＜6 d時(shí)，進(jìn)入后酵時(shí)的殘?zhí)呛枯^高，發(fā)酵液最后的殘?zhí)呛扛?，酒精度較低，影響啤酒的口味；主酵時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，酵母菌沉降速率快，不利于雙乙酰的還原。

在感官評(píng)定方面，主酵時(shí)間為4 d時(shí)，啤酒甜味較重，口感不爽口；主酵時(shí)間為6 d時(shí)，口感清爽，無(wú)異味；主酵時(shí)間為8 d時(shí)，啤酒有酸敗味，可能是由于主酵時(shí)間長(zhǎng)，雙乙酰峰值延后，后期雙乙酰還原不徹底造成的。綜合理化指標(biāo)和感官評(píng)定，主酵時(shí)間為6 d時(shí)菱角啤酒的條件最佳。

2.4 后酵時(shí)間對(duì)菱角啤酒還原糖和酒精度的影響

圖4 后酵時(shí)間對(duì)菱角啤酒還原糖含量和酒精度的影響Fig.4 Effect of post-fermentation time on reducing sugar and alcohol content in water chestnut beer

設(shè)置后酵時(shí)間為9 d、11 d、13 d、15 d、17 d，酵母菌添加量為0.5%，菱角汁添加量為20%，主酵時(shí)間6 d，主酵溫度10 ℃，后酵溫度4 ℃。檢測(cè)還原糖下降曲線和酒精度的變化曲線，結(jié)果見圖4，并對(duì)啤酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，確定最佳后酵時(shí)間。

由圖4可知，發(fā)酵液進(jìn)入后酵，酵母菌沉降，發(fā)酵液泡沫減少，還原糖下降緩慢。后酵13 d后還原糖、酒精度基本平穩(wěn)，鏡檢發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的酵母數(shù)很少。因此，菱角啤酒發(fā)酵的后酵時(shí)間13 d為宜，周期太長(zhǎng)，生產(chǎn)成本增加。

2.5 啤酒中理化指標(biāo)的變化

綜上所述，菱角啤酒的最優(yōu)發(fā)酵條件為：酵母接種量0.5%，菱角汁添加量20%，主酵時(shí)間6 d，后酵時(shí)間13 d。在此條件下進(jìn)行菱角啤酒發(fā)酵，檢測(cè)發(fā)酵液中還原糖，酒精度，雙乙酰的變化，并與不加菱角汁的啤酒中3種物質(zhì)的含量進(jìn)行對(duì)比，其變化曲線見圖5。

圖5 啤酒中酒精度、還原糖、雙乙酰的變化趨勢(shì)Fig.5 Change of alcohol,reducing sugar and diacetyl content in water chestnut beer

由圖5可知，添加菱角汁的啤酒初始還原糖含量低，在發(fā)酵過(guò)程中糖降速率小，還原糖在主酵3～6 d時(shí)下降速率快。發(fā)酵結(jié)束時(shí)添加菱角汁的啤酒中還原糖的含量高于不添加菱角汁的啤酒。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，啤酒中雙乙酰含量先增大后逐漸降低，且菱角啤酒的雙乙酰含量低，口感清爽。酒精主要是在主酵中后期和后酵前期產(chǎn)生，后酵后期酒精度變化平穩(wěn)。綜上所述，添加菱角汁啤酒初始還原糖的含量低，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的還原糖含量高，酒精度較低，雙乙酰含量略低，菱角中的某些成分可能影響酵母菌的代謝，有待進(jìn)一步證實(shí)。

2.6 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

2.6.1 菱角啤酒感官指標(biāo)

清澈透明，無(wú)明顯的懸浮物和沉淀物；起泡性好，泡沫細(xì)膩，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，掛杯持久。具有明顯的菱角味，有酒花香；菱角啤酒口感爽口，苦味值大，殺口力強(qiáng)，無(wú)異雜味。

2.6.2 菱角啤酒理化指標(biāo)

以不加菱角汁的啤酒作為對(duì)照，菱角啤酒檢測(cè)的理化指標(biāo)結(jié)果見表2。

表2 菱角啤酒的理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical indexes of water chestnut beer

2.6.3 菱角啤酒衛(wèi)生指標(biāo)

菌落總數(shù)＜50 CFU/mL；大腸桿菌數(shù)＜3 MPN/100mL，衛(wèi)生指標(biāo)符合GB2758—2012《發(fā)酵酒及其配制酒》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

菱角啤酒的最優(yōu)發(fā)酵條件為：酵母接種量0.5%，菱角汁添加量20%，主酵時(shí)間6 d，后酵時(shí)間13 d。在此條件下，啤酒中還原糖殘留量為1.63 g/100 mL，酒精度達(dá)3.52%vol，雙乙酰含量為0.06 mg/L。釀制的啤酒清澈透明，呈琥珀色，無(wú)沉淀物。泡沫豐富細(xì)膩，持久性長(zhǎng)?？诟星逅辔秴f(xié)調(diào)，品質(zhì)良好，理化及衛(wèi)生指標(biāo)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

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