黃賢剛，管 斌 *，魯 曾，胡曉文

（1.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院 海洋工程學(xué)院，山東 日照 276826；2.中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

黑木耳（Auricularia auricula）是一種藥食兩用大型真菌，富含膠質(zhì)、磷脂和纖維素，具有潤(rùn)肺、清腸等功能，其中的黑木耳多糖成分具有抗凝血、抗腫瘤、抗炎癥、降血糖、抗輻射等生理功能，具有極大的開發(fā)利用價(jià)值[1]。蘋果醋是以蘋果為主要原料，經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵而成，含有豐富的有機(jī)酸，開胃、促消化，能抑制體內(nèi)氧化物的形成，具有抗疲勞、抗衰老等生理功用[2]。利用液體深層發(fā)酵后的黑木耳菌絲體和壓榨得到的蘋果汁，共同進(jìn)行酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵，再通過口味調(diào)配加工而成的黑木耳蘋果醋飲料，既最大限度地促進(jìn)黑木耳和蘋果的合理開發(fā)利用，又集兩者的滋補(bǔ)功效和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值于一體，具有廣闊的市場(chǎng)前景[3-4]。本研究以濃縮蘋果汁和黑木耳菌絲體為原料，探討確定黑木耳蘋果醋飲料酒精發(fā)酵過程的工藝參數(shù)，通過單因素試驗(yàn)對(duì)初始糖度、發(fā)酵溫度、pH值、酵母接種量等做出初步判斷，然后通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到回歸模型并預(yù)測(cè)最大值，利用模型優(yōu)化得到各因素共同作用下的最佳工藝條件并通過試驗(yàn)驗(yàn)證，為黑木耳蘋果醋飲料酒精發(fā)酵試驗(yàn)及中試生產(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮蘋果汁（可溶性固形物70.0%～72.0%，酸度0.7%，pH 3.6～4.4）、斜面培養(yǎng)基（2%瓊脂，麥芽汁10°Bx，pH6.4）：日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程技術(shù)中心提供；酵母（BM45）：日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品研究所提供；發(fā)酵的原料液：破壁勻漿的菌絲體與兩倍稀釋滅菌的濃縮蘋果汁以重量比9∶1混勻；白砂糖：市售；酵母浸膏（BR）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂（食品級(jí)）：東海瓊膠食品有限公司；葡萄糖（分析純）、檸檬酸（分析純）：上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純）：天津登科化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備[6，9]

GHP-9080隔水恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；202-2A鼓風(fēng)干燥箱：龍口先科儀器公司；YXQ-LS-50全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；AR2140電子天平：美國(guó)奧豪斯公司；PHS-3C酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；7890A氣相色譜儀：配有FID檢測(cè)器自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱HP-FFAP（30 m×0.25 mm×0.5 μm），安捷倫科技有限公司；糖度計(jì)：北科新宇公司；ZHWY-2102恒溫振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；磁力攪拌器：龍口先科儀器公司；SP-721E可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程[7]

1.3.2 初始糖度單因素試驗(yàn)

分別將發(fā)酵原液初始糖度調(diào)至8°Bx、10 °Bx、12°Bx、14°Bx、16°Bx、18°Bx 6個(gè)梯度，再接入5%已活化的酵母液進(jìn)行發(fā)酵，溫度控制在28 ℃，直到發(fā)酵過程停止。期間固定間隔時(shí)間測(cè)定發(fā)酵完畢后的酒精度和殘余糖度。

1.3.3 發(fā)酵溫度單因素試驗(yàn)

原液中接入5%已活化的酵母液，置入培養(yǎng)箱中發(fā)酵，溫度分別控制在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃5個(gè)梯度，直至酒精度上升緩慢，發(fā)酵停止。期間固定間隔時(shí)間測(cè)定發(fā)酵液的酒精度和殘余糖度。

1.3.4 pH單因素試驗(yàn)

將調(diào)糖配置的發(fā)酵原液的pH值分別控制在3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，接入5%已活化的酵母液，置入培養(yǎng)箱中發(fā)酵，溫度控制在28 ℃，直至酒精度上升緩慢，發(fā)酵過程停止。期間定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的酒精度和殘余糖度。

1.3.5 接種量單因素試驗(yàn)

分別向處理好的發(fā)酵原液中接入3%、4%、5%、6%、7%、8%已活化的酵母菌，置入培養(yǎng)箱發(fā)酵，溫度控制在28 ℃，直至酒精度上升緩慢，發(fā)酵活動(dòng)停止。期間定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的酒精度和殘余糖度。

1.3.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8，12]

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇初始糖度、發(fā)酵溫度、pH值、接種量4個(gè)因素，以酒精度（Y）為指標(biāo)，利用Box-Behnken法，選取三個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化研究，建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，進(jìn)一步探求各因素共同作用下的最佳發(fā)酵條件。因素與水平編碼表見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.3.7 酒精發(fā)酵動(dòng)態(tài)曲線

根據(jù)得到的最佳工藝參數(shù)，在28 ℃、pH值5.0條件下，將6%的酵母菌接入到初始糖度14.5°Bx的原料液中發(fā)酵，至殘余糖度和酒精度變化均不再明顯時(shí)結(jié)束。定時(shí)測(cè)定殘余糖度、酒精度變化情況。

1.3.8 測(cè)定方法

酒精度測(cè)定[9]：色譜法，柱溫50 ℃，氣化室和檢測(cè)器溫度240 ℃，載氣（高純氮）流量30 mL/min，氫氣流量30 mL/min，空氣流量：300 mL/min；可溶性固形物測(cè)定：糖度計(jì)；總糖測(cè)定：GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理方法

單因素試驗(yàn)通過3平行試驗(yàn)取平均值。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.05軟件設(shè)計(jì)4因素3平分析試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始糖度對(duì)黑木耳蘋果醋飲料酒精發(fā)酵的影響[8]

圖1 初始糖度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on alcohol fermentation

初始糖度對(duì)黑木耳蘋果醋飲料酒精發(fā)酵的影響見圖1。由圖1分析可知，隨著初始糖度的遞增，發(fā)酵完畢后料液中的酒精度呈上升趨勢(shì)。其主要原因是初始糖度較低時(shí)，可供酵母菌利用的糖分較少，不利于酒精發(fā)酵的進(jìn)行；隨著初始糖度的增加，同等條件下酒精發(fā)酵作用進(jìn)行明顯；初始糖度達(dá)到14°Bx以上時(shí)，發(fā)酵完畢后的酒精度增加無明顯變化，殘余糖度逐漸增多，這主要是因?yàn)榘l(fā)酵液中不斷增高的酒精度對(duì)酵母菌生長(zhǎng)有所抑制，初始投入的糖原料不能充分利用。因此，初始糖度以14°Bx較適宜。

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳蘋果醋飲料酒精發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳蘋果醋飲料酒精發(fā)酵的影響見圖2。由圖2分析可知，酒精度隨著溫度的升高不斷增大，28 ℃時(shí)酒精度最大，酒精發(fā)酵效果較好，這說明溫度影響酵母菌的細(xì)胞活力；超過28 ℃后，隨著溫度的升高，酒精度逐漸下降，這一方面可能是由于溫度過高抑制了酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，另一方面可能由于溫度的升高造成部分酒精的揮發(fā)，從而使得酒精度值變小。因此，選擇28 ℃發(fā)酵溫度較適宜。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of temperature on alcohol fermentation

2.3 pH值對(duì)黑木耳蘋果醋飲料酒精發(fā)酵的影響

圖3 pH值對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of pH on alcohol fermentation

pH值對(duì)黑木耳蘋果醋飲料酒精發(fā)酵的影響見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)pH值為3.5～5.0時(shí)，酒精度不斷增加且迅速，pH值為5.0時(shí)酒精度達(dá)到最大；當(dāng)pH值＞5.0后，發(fā)酵液的酒精度呈下降趨勢(shì)。這說明酵母菌的酒精發(fā)酵作用受到溶液酸堿度的影響，在發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的pH值會(huì)隨著微生物的生長(zhǎng)和代謝而不斷變化，可能會(huì)偏離酵母菌適宜生長(zhǎng)或者產(chǎn)物累積的pH值。因此，pH值初定在5.0。

2.4 接種量對(duì)黑木耳蘋果醋飲料酒精發(fā)酵的影響

圖4 接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of inoculum on alcohol fermentation

接種量對(duì)黑木耳蘋果醋飲料酒精發(fā)酵的影響見圖4。由圖4分析可知，酵母菌接種量為5%時(shí)，酒精度達(dá)到最大。其中原因主要是由于接種量過小造成了酵母菌自身繁殖消耗過多，而用于發(fā)酵的消耗較少；接種量超過一定值也會(huì)增加酵母菌用于生長(zhǎng)的消耗，從而造成酒精度的下降。

2.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，安排了29組試驗(yàn)組合，每組3次平行試驗(yàn)發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別測(cè)定其酒精度取平均值[10]，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Result and analysis of Box-Behnken experiment

利用Design-Expert 8.05軟件，以酒精度為響應(yīng)值，對(duì)表2進(jìn)行多元回歸擬合，得到工藝參數(shù)初步回歸模型：

模型的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experiment

從表3可知，模型（1）的F值為39.92，P值＜0.000 1，說明該模型具有高度顯著性，模型擬合度較好，能對(duì)酒精度進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；失擬項(xiàng)P=0.131 8＞0.05，影響不顯著，表明回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M合，可以用此模型對(duì)黑木耳蘋果醋酒精發(fā)酵階段的酒精度進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

由回歸方程各變量的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型的一次項(xiàng)A、C、D影響極顯著（P＜0.01），B影響不顯著（P＞0.05）；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響均極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)AD影響極顯著（P＜0.01），BC影響顯著（P＜0.05），AB、AC、BD、CD影響不顯著（P＞0.05）。依據(jù)方程各變量系數(shù)的大小可知，初始糖度、接種量對(duì)酒精度影響最大，其次pH值，最后是發(fā)酵溫度。

剔除不顯著項(xiàng)，經(jīng)優(yōu)化后回歸模型為：

對(duì)回歸方程（2）進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，模型各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)均達(dá)到理想指標(biāo)，其中決定系數(shù)R2為0.966 2，說明96%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用這個(gè)方程解釋[11-12]。

2.6 響應(yīng)面分析

在交互項(xiàng)中，初始糖度（A）和接種量（D）的交互作用影響極顯著，發(fā)酵溫度（B）和pH值（C）的交互作用影響顯著[13]。利用Design-Expert 8.05軟件繪出兩者相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖[14]，如圖5、圖6所示。

圖5 初始糖度(A)和接種量(D)的交互作用對(duì)酒精度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction effect between initial sugar content (A) and inoculum (D) on alcohol content in fermentation

圖6 發(fā)酵溫度(B)和pH值(C)的交互作用對(duì)酒精度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour plots of the interaction effect between temperature (B) and pH(C) on alcohol contect in fermentation

從圖5可知，在發(fā)酵溫度28 ℃、pH值為5.0情況下，當(dāng)初始糖度較低時(shí)，酒精度隨著初始糖度的增加而不斷上升，但當(dāng)初始糖度超過14°Bx后，酒精度隨著初始糖度的增加而降低，酒精度呈拋物線變化。接種量在初始糖度較低時(shí)，對(duì)酒精度的影響不大，隨著初始糖度的增加，對(duì)酒精度的影響逐漸明顯，但當(dāng)初始糖度超過14°Bx后，對(duì)酒精度的影響又趨于平緩。這主要是接種量過小時(shí)酵母菌自身消耗多，過多時(shí)也會(huì)增加自身用于生長(zhǎng)的消耗，和單因素試驗(yàn)結(jié)果吻合。在初始糖度13～15°Bx和接種量4%～6%范圍內(nèi)，酒精度可以達(dá)到試驗(yàn)最大值。

由圖6可知，在初始糖度14°Bx、接種量5%的情況下，隨著發(fā)酵溫度的升高，酒精度呈拋物線狀態(tài)。pH值則在較低和較高時(shí)，對(duì)酒精度的影響不明顯，這主要因?yàn)榘l(fā)酵液的pH值會(huì)隨著微生物的生長(zhǎng)和代謝而不斷變化，對(duì)酒精度的生成有所影響。在發(fā)酵溫度27～29 ℃和pH 4.5～5.5范圍內(nèi)，酒精度可以達(dá)到試驗(yàn)最大值。

在試驗(yàn)結(jié)果分析及模型擬合的基礎(chǔ)上，利用軟件分析計(jì)算得到回歸方程的最大值，即在初始糖度14.42°Bx、發(fā)酵溫度28.01 ℃、pH值5.13、接種量6%時(shí)，預(yù)測(cè)最大值為6.72%vol。根據(jù)試驗(yàn)條件和實(shí)際操作方便性，將工藝條件修正為初始糖度14.5 °Bx、發(fā)酵溫度28 ℃、pH值5.0、接種量6%時(shí)，發(fā)酵7 d，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到的酒精度平均值為6.63%vol，接近預(yù)測(cè)值，說明模型較為準(zhǔn)確，對(duì)于黑木耳蘋果醋酒精發(fā)酵條件的研究具有指導(dǎo)意義[15]。

2.7 黑木耳蘋果醋酒精發(fā)酵的動(dòng)態(tài)曲線

將得到的試驗(yàn)結(jié)果繪制成曲線，見圖7。

圖7 酒精發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化曲線Fig.7 Dynamic curve of alcohol fermentation

從圖7可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，殘余糖度隨時(shí)間的延續(xù)不斷下降，而酒精度則呈上升趨勢(shì)[16]。前2天，糖度持續(xù)下降，但酒精度的變化趨勢(shì)稍緩慢，這主要是發(fā)酵初期，酵母菌仍處于有氧期，菌體繁殖較快但發(fā)酵作用較緩慢；第3天，發(fā)酵作用逐漸增強(qiáng)，伴隨產(chǎn)生大量氣泡，酒精味道變得愈來愈濃重，這段時(shí)間為發(fā)酵主要時(shí)期，溫度、pH值等條件適宜，酵母菌處于無氧條件，發(fā)酵作用持續(xù)增強(qiáng)，酒精度上升明顯，殘余糖度快速下降；第6天后，酒精度和殘余糖度的變化趨于平緩，不斷有產(chǎn)物沉淀，酒精含量累積到最大，糖的消耗量降至最低，此時(shí)由于發(fā)酵液中一些酵母菌菌體代謝消耗，加上較高濃度的酒精對(duì)酵母的生長(zhǎng)發(fā)酵活動(dòng)的抑制作用，發(fā)酵過程趨于緩和；第7天，糖分參與發(fā)酵轉(zhuǎn)化過程基本完成，酒精度也基本達(dá)到最大值，不再上升，此時(shí)發(fā)酵過程結(jié)束。因此，發(fā)酵時(shí)間選擇7d為宜。

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析，確定了黑木耳蘋果醋酒精發(fā)酵過程的最佳工藝參數(shù)組合：初始糖度14.5°Bx，發(fā)酵溫度28 ℃，pH值5.0，接種量6%，發(fā)酵時(shí)間7d，通過試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，此時(shí)的酒精度可達(dá)到6.63%vol，與預(yù)測(cè)值接近。這些參數(shù)的獲取和模型的建立為黑木耳蘋果醋酒精發(fā)酵的實(shí)際生產(chǎn)提供了參考數(shù)據(jù)，具有較強(qiáng)的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

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