梁孝祺 陳金金 俞超 盛夢俊

貝母屬Fritillaria 是百合科Liliaceae 中的一個大屬，主要分布于北半球的溫帶地區(qū)，常以干燥的鱗莖入藥，具有清熱潤肺、止咳化痰的功效。近年來，大量的貝母新種和變種被發(fā)現(xiàn)，保守估計已被發(fā)現(xiàn)的貝母屬物種超過80 種，變種超過50 種［1］，但在臨床處方上通常僅將川貝母與浙貝母兩大類進(jìn)行區(qū)分，或是通過中醫(yī)所稱的6 個道地產(chǎn)區(qū)進(jìn)行劃分:伊貝母、川貝母、平貝母、湖北貝母、浙貝母及皖貝母。貝母是典型的多基原藥材，如川貝母，在《中華人民共和國藥典》(一部)中將卷葉貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母統(tǒng)稱為川貝母，而后又加入瓦布貝母和太白貝母［2］。貝母的多基原性和龐大的物種基數(shù)，給其在流通、育種過程中的物種鑒定帶來了困難。本文就貝母屬藥用植物的分類鑒定方法進(jìn)行了分析整理，就形態(tài)學(xué)、化學(xué)成分多樣性、分子標(biāo)記等方面對貝母屬鑒定方法作一綜述，并比較不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定是中藥材最基本的鑒定方法，通過對藥材植株的形態(tài)特征及其外觀的顯微特征存在的差異來鑒別不同的藥材。但是僅僅通過植株外形進(jìn)行鑒別，難以判斷受到環(huán)境影響造成植物發(fā)育上的差異，且在近緣植物中往往缺乏足夠明顯的不同點(diǎn)。

隨著顯微技術(shù)的發(fā)展，通過花粉形態(tài)和淀粉顆粒形態(tài)鑒定貝母屬藥材成為主流，1996年羅毅波等［3］通過花被片、花藥、花粉表面紋飾等特性的分析，對中國橫斷山區(qū)及臨近地區(qū)及長江中下游地區(qū)的貝母屬植物進(jìn)行了分類學(xué)修訂，對暗紫貝母Fritillaria unibracteata、天目貝母Fritillaria monantha、浙貝母Fritillaria thunbergii 中的部分物種進(jìn)行了歸并。2002年何斜［4］則通過淀粉顆粒的直徑、臍點(diǎn)形狀、氣孔等特征成功對五大貝母類群進(jìn)行了區(qū)分，明確區(qū)別了浙貝母、川貝母、平貝母和伊貝母四種常見藥用貝母。濮祖茂等［5］對植物葉表面掃描電鏡觀察，對云南貝母屬藥用植物川貝母Fritillaria cirrhosa、梭砂貝母Fritillaria delavayi 等進(jìn)行了聚類分析，確定了不同貝母葉表面的特征具有差異性，也可作為聚類分析的依據(jù)。

2 化學(xué)成分多樣性鑒定

不同種類的藥材，其化學(xué)成分必然存在差異，而同種藥材，其主要成分的含量也存在差異。通過薄層色譜法、高效液相色譜法、熱分析法及紅外光譜法等，對不同貝母的化學(xué)成分差異進(jìn)行分析，進(jìn)而對其進(jìn)行區(qū)分。

肖培根等［1］在貝母親緣學(xué)研究中列舉了從29類貝母屬植物中分離鑒定出的120 多個生物堿，并指出了不同貝母所含生物堿種類和含量的差異。如浙貝甲素、浙貝乙素及西貝素在不同貝母中存在典型性的差異，西貝素僅存在于高海拔西部地區(qū)如四川、甘肅、新疆等產(chǎn)地的川貝母、康定貝母、伊貝母等，而浙貝甲素、浙貝乙素僅存在于東南部低海拔地區(qū)產(chǎn)地的浙貝母、安徽貝母、湖北貝母等［6］。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)是目前主流的貝母化學(xué)成分多樣性鑒定方法，其利用不同化合物在流動相中的移動速度不同這一特點(diǎn)，通過色譜柱對液相中的化合物進(jìn)行分子水平的分離，并形成對應(yīng)分離時間的不同化合物信號強(qiáng)度峰圖，以此比對不同貝母化學(xué)成分(主要是生物堿)種類及含量的差異。王聰?shù)龋?］在對川貝母的HPLC 指紋圖譜研究中發(fā)現(xiàn)了川貝母復(fù)合群的成分指紋具有共同特征，并直觀區(qū)別了川貝母復(fù)合群與浙貝母。但蔡曉翠等［8］通過HPLCELSD 指紋圖譜對10 批不同種植區(qū)的伊貝母進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，10 批伊貝母色譜峰圖譜整體特征相似度高，但伊犁不同產(chǎn)區(qū)伊貝母中西貝母堿含量有明顯差異，即使是同一產(chǎn)區(qū)，不同時期采集的伊貝母西貝母堿含量也有差異。液相色譜法的缺點(diǎn)即是難以排除自然環(huán)境、栽培方法等對植株化學(xué)成分及含量的影響。針對這一影響特點(diǎn)，周建良等［9］運(yùn)用快速液相色譜(rapid resolution liquid chromatography，RRLC)分析了不同產(chǎn)地浙貝母的主成分特征圖譜，強(qiáng)調(diào)了在高度精確的定量分析基礎(chǔ)上各藥材之間化學(xué)成分及含量上的差異，不僅能作為不同貝母品種的區(qū)分依據(jù)，還為區(qū)分同種藥材產(chǎn)地和采收季節(jié)及藥材的規(guī)格、品級提供了快速直觀的定量數(shù)據(jù)支持。

2.2 其它生化鑒定方法

為解決HPLC、薄層色譜法等分析技術(shù)操作繁瑣，分析周期長的問題，楊復(fù)森等［10］將便攜式近紅外光譜儀運(yùn)用到了貝母屬中藥鑒定中，在對川貝母的種群識別、不同基原品種的定性分析和混偽品的鑒別中均取得了理想的效果，且大大降低了實驗流程消耗的時間和成本。陳效忠等［11］則運(yùn)用操作簡單、價格低廉的電化學(xué)振蕩技術(shù)，通過電化學(xué)指紋圖譜反映藥材整體化學(xué)成分的差異，成功區(qū)分川貝母、平貝母和浙貝母等藥材，為中藥材的快速鑒定提供了新思路。

3 分子標(biāo)記鑒定

從分子遺傳學(xué)角度來看，物種表現(xiàn)型的差異歸根結(jié)底應(yīng)追溯到基因型的差異，即在DNA 序列上的差異，而且這種差異不受環(huán)境和個體差異的影響。因此，對基因組序列差異的比較研究無疑為植物分類和鑒定提供了本質(zhì)依據(jù)。隨著生命科學(xué)技術(shù)不斷取得重大突破，分子生物學(xué)鑒定方法應(yīng)運(yùn)而生，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定中藥基原植物及飲片取得了快速發(fā)展。

3.1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記技術(shù)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)興起于1990年，是基于RFLP 技術(shù)的第二代分子標(biāo)記技術(shù)，具有操作簡單，成本低廉的優(yōu)勢。其運(yùn)用隨機(jī)合成的短序列引物(8-12bp)以基因組DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，由于其DNA 上發(fā)生堿基的插入、缺失而使隨機(jī)引物無法結(jié)合，從而使產(chǎn)生的DNA 圖譜呈現(xiàn)多態(tài)性。該技術(shù)的特點(diǎn)是不需要基因探針，即使是完全未知的序列，也能擴(kuò)增出多態(tài)性片段。

2009年，陸含等［12］運(yùn)用RAPD 技術(shù)對浙貝母4個品種及5 種貝母屬藥材進(jìn)行了分析。根據(jù)多態(tài)性片段分析結(jié)果，將4 個浙貝母品種聚類在一起，而5種貝母屬藥材中，浙貝母的變種—東貝母與浙貝母最為接近，伊貝母與浙貝母關(guān)系最遠(yuǎn)，其結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)相符。龔伯奇［13］則通過RAPD 技術(shù)對青海省四個地區(qū)的暗紫貝母遺傳多樣性進(jìn)行分析，獲得的多態(tài)性信息準(zhǔn)確地將每個樣地的樣品聚類在一起，并強(qiáng)調(diào)了RAPD 技術(shù)在種下等級的鑒定效力。在鑒定的穩(wěn)定性方面，周潔［14］運(yùn)用RAPD 標(biāo)記和ISSR 標(biāo)記對12 個浙貝母品種進(jìn)行了分子鑒定，區(qū)分了磐安本地種植的貝母和引種貝母類群，并發(fā)現(xiàn)RAPD 的聚類結(jié)果與ISSR 標(biāo)記得到的聚類結(jié)果基本一致，肯定了RAPD 技術(shù)的鑒定準(zhǔn)確性。

3.2 簡單重復(fù)區(qū)間標(biāo)記技術(shù)

簡單重復(fù)區(qū)間標(biāo)記技術(shù)(inter-simple sequence repeat，ISSR)是對SSR 技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)后的新型分子標(biāo)記技術(shù)，又稱為微衛(wèi)星—錨定PCR 技術(shù)。DNA 在復(fù)制及修復(fù)過程中DNA 的滑動和錯配，或者減數(shù)分裂期間姐妹染色單體的不均等交換均會產(chǎn)生簡單重復(fù)區(qū)間(simple sequence repeat，SSR)，這些區(qū)間的兩端多為保守的單拷貝序列，且SSR 在整個基因組中分布較為均勻，在不同品種間變異廣泛。ISSR 技術(shù)以SSR 序列為引物并在3’端或者5’端加上2～4個隨機(jī)核苷酸，PCR 過程中使錨定引物引起特意位點(diǎn)的退火，使重復(fù)序列間DNA 片段成功擴(kuò)增。由于不同物種和品種的SSR 在基因組中的位置和數(shù)量均有差異，故擴(kuò)增結(jié)果將表現(xiàn)出多態(tài)性［15］。劉曉賢等［16］運(yùn)用ISSR-PCR 技術(shù)，對8 個浙貝母居群、1 個東貝母居群、1 個皖貝母居群和2 個川貝母居群進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)磐安地區(qū)的浙貝居群已明顯區(qū)別于其他產(chǎn)區(qū)浙貝居群，并且長期的留種栽培使磐安浙貝遺傳多樣性水平降低，形成相對穩(wěn)定的遺傳。王果平等［17］同樣通過ISSR 技術(shù)，對新疆貝母屬遺傳多樣性進(jìn)行了聚類分析，將十種貝母分為三個類群。結(jié)果顯示，大白花貝母、小白花貝母、黃花貝母和托里貝母聚類在了一起，這與羅毅波等［3］提出觀點(diǎn)相吻合，對于戈壁貝母的分類也和前人的研究結(jié)果一致。

雖然ISSR 兼具了RAPD 的簡便性和SSR 的穩(wěn)定性，但對于反應(yīng)體系的要求較為嚴(yán)格，趙鑫等［18］研究了TagDNA 聚合酶用量、dNTP、引物和Mg2+濃度四種因素對伊貝母ISSR-PCR 擴(kuò)增的影響，確定了適于伊貝母ISSR 的反應(yīng)體系，這對其他貝母屬藥用植物的ISSR 反應(yīng)體系建立有指導(dǎo)作用。

3.3 DNA 條形碼技術(shù)

DNA 條形碼技術(shù)(DNA barcode)通過選取普遍性高且在種內(nèi)遺傳較為穩(wěn)定但種間進(jìn)化速率較快的DNA 序列，設(shè)計相應(yīng)的引物，通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增出待鑒定物種的對應(yīng)DNA 片段序列，通過直接測序的方法獲得序列信息，運(yùn)用MEGA 等軟件比對序列信息，便能對其進(jìn)行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)件，具有操作簡單，鑒定效率高，重復(fù)性強(qiáng)，不受樣品個體差異和環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)［19］。陳士林等［20］在對2373份藥材樣品的研究基礎(chǔ)上，提出了以核基因ITS2 序列為核心葉綠體基因psbA-trnH 序列為輔的中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，ITS2 序列是作為貝母屬藥用植物條形碼鑒定的理想序列。在對貝母屬的近緣屬——重樓屬的研究中，朱英杰等［21］對psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK 和核ITS2 序列的PCR 擴(kuò)增成功率和鑒定效率進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)ITS2序列鑒定效果最好，在29 個物種67 份樣品中的鑒定效率為100%，可將中國大部分重樓屬物種準(zhǔn)確區(qū)分開來，且在種內(nèi)幾乎不存在差異。

基于ITS2 序列在百合科部分屬中的成功應(yīng)用，羅焜等［22］同樣運(yùn)用ITS2 序列對川貝母及其混偽品進(jìn)行了鑒定。其結(jié)果表明，ITS2 序列能準(zhǔn)確區(qū)分川貝母基原植物與其混偽品，并將六種不同的川貝母基原植物:卷葉貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭沙貝母、太白貝母、瓦布貝母聚類在一起，驗證了藥典的正確性。另外，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，川貝母、甘肅貝母、梭沙貝母的多個樣品呈多物種交錯狀，推測其川貝母復(fù)合群可能是處于激烈分化的物種形成階段，一些種下等級在不同地區(qū)，植物形態(tài)和花部特征出現(xiàn)差異，而被劃分為不同物種，此推論與肖培根等［1］的討論相符。

3.4 其它分子標(biāo)記技術(shù)

表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，ESTs)技術(shù)，是利用逆轉(zhuǎn)錄酶，對編碼蛋白質(zhì)的mRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建物種cDNA 文庫，并對文庫中的克隆進(jìn)行大規(guī)模測序，通過ESTs 圖譜區(qū)分基因水平的差異。目前，在川貝母的cDNA 文庫中，已有超過2158 條高品質(zhì)的ESTs 序列信息，和超過1343 個獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組［23］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)包括HMGR、CYP450s、FPSs 和氨基酸轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)的數(shù)十個川貝母生化活性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄集合，這為進(jìn)一步研究貝母甾體生物堿合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組基因鑒定技術(shù)提供了技術(shù)支持。ESTs 序列還有望用于探究同源基因在保守物種之間進(jìn)化水平的差異，是潛在的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記［24］。

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)技術(shù)是建立在RFLP 技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，利用EcoRI、PstI 及SacI 等限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，形成酶切位點(diǎn)不同、分子量大小不等的隨機(jī)性酶切片段，在其兩端接上雙鏈人工接頭后，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳后獲得具有多態(tài)性的指紋圖譜。徐金中等［25］運(yùn)用AFLP分析了浙江主產(chǎn)區(qū)浙貝母的種質(zhì)遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)AFLP 技術(shù)在不同產(chǎn)地浙貝母中具有豐富的遺傳多樣性，其聚類關(guān)系也與產(chǎn)地有明顯的關(guān)聯(lián)性。在地理位置上較近的東陽、磐安、永康、縉云產(chǎn)地的貝母遺傳距離同樣較近，而浙貝母最初的產(chǎn)地象山浙貝母居群與其他居群相對獨(dú)立，這進(jìn)一步表明象山浙貝母居群遺傳基因較為保守，與其他遷徙居群形成明顯差異。

4 總結(jié)及展望

綜合大量研究結(jié)果，對各種方法進(jìn)行了總結(jié)分析，其不同鑒定方法的優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示。

在對不同方法的比較中，肖培根、羅焜等均認(rèn)為，從基因角度入手，深入到遺傳物質(zhì)遺傳分化的研究對貝母屬以及其它藥用植物的鑒定具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可重復(fù)的優(yōu)勢。而DNA 條形碼技術(shù)，是現(xiàn)階段內(nèi)非常適合作為藥用植物大批量快速鑒定的技術(shù)，其條形碼序列ITS2 片段，存在于細(xì)胞核中，適用于貝母鱗莖干片、粉末等市場流通樣品的鑒定，鑒定效果理想［22，31］。系統(tǒng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的DNA 條形碼鑒定技術(shù)能夠貫穿中藥材種植、加工、生產(chǎn)、流通等各個環(huán)節(jié)，實現(xiàn)對中藥材基原物種、粉末、組織等材料來源的快速鑒定［20］，在生物物種監(jiān)管、藥材市場管理、生物多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化研究等方面有著巨大的潛在作用，能很好地解決貝母市場魚龍混雜，各個相似品種間以次充好的現(xiàn)象。

綜上所述，對于貝母屬植物以及其它中藥材的鑒定，無論是生化標(biāo)記還是分子標(biāo)記，都走向一個數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的過程，在新技術(shù)方面，期望隨著生物技術(shù)的發(fā)展，ESTs 技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)、SNP技術(shù)和基因芯片技術(shù)能為貝母屬藥用植物研究提供有力幫助［32］。

表1 在貝母屬中不同鑒定方法的優(yōu)劣分析

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