阮潔 趙軍 袁圓 李紅玲 王建華

黑加侖Ribes nigrum L 學(xué)名黑穗醋栗，又名黑醋栗，虎耳草目茶麓子科茶麓子屬植物，小型灌木。黑加侖果實(shí)中含有多種維生素、黃酮、花青素等，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值［1］，黑加侖籽粉是從黑加侖果實(shí)加工后的果渣中分離而得的種子，含有油、蛋白質(zhì)、總糖、黃酮、花青素等活性物質(zhì)［2］，目前國外有文獻(xiàn)報(bào)道［3-4］證實(shí)黑加侖籽油具有降壓作用，推測其有效成分為γ-亞麻酸，與黑加侖籽油相比，黑加侖籽粉除含有籽油外還含有更多的活性成分，且黑加侖籽粉不易酸敗，貯存條件要求很低，γ-亞麻酸更穩(wěn)定，可直接入藥制備固體制劑，成本更低，但對(duì)其降壓作用未見文獻(xiàn)報(bào)道。故本研究采用兩腎一夾高血壓大鼠模型，初步探討黑加侖籽粉對(duì)血壓的作用及相關(guān)指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2014年2月7日購進(jìn)SPF 級(jí)SD 大鼠，鼠齡2月，體重200 ～220 g，SYXK(新)2011-0004，雄性，50 只，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥品與試劑

黑加侖籽粉:新疆維帝食品有限責(zé)任公司，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥檢所鑒定符合新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品監(jiān)督局2008年頒布的藥材標(biāo)準(zhǔn);卡托普利片:中美上海施貴寶制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字H31022986。一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒(硝酸還原酶法)，批號(hào):20140516，購自南京建成生物工程研究所;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(WST-1 法)，批號(hào):20140530，購自南京建成生物工程研究所;丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)試劑盒(TBA 法)，批號(hào):20140528，購自南京建成生物工程研究所;內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)酶聯(lián)免疫試劑盒，批號(hào):A06137312，購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

BP-6A 型全自動(dòng)無創(chuàng)血壓測量儀(成都泰盟科技有限公司)，銀夾(上海奧爾科特生物科技有限公司)，低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)，BP211D 電子天平(德國Sartorius)，P310S-OCE精密天平(德國Sartorius)。

1.4 兩腎一夾(2 K1C)腎性高血壓大鼠模型的制備

大鼠購進(jìn)后適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，進(jìn)行左腎動(dòng)脈狹窄手術(shù)，術(shù)前禁食不禁水12 小時(shí)，將大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛0.3 ml/100 g 麻醉，仰臥位固定，無菌操作沿下腹正中作縱行切口，于左腎近腎門處用眼科鑷小心鈍性分離左腎動(dòng)脈后，用0.2 mm銀夾將其狹窄，然后縫合腹部切口，碘酒消毒。手術(shù)后4 周，收縮壓＞140 mmHg 者作為腎血管性高血壓大鼠。另取未造模的8 只大鼠手術(shù)方法同上，但不狹窄腎動(dòng)脈，作為假手術(shù)組。術(shù)后大鼠肌肉注射青霉素8 萬單位抗炎4 天［5］。

1.5 試驗(yàn)分組及給藥

將42 只大鼠進(jìn)行左腎動(dòng)脈狹窄手術(shù)，術(shù)后1 個(gè)月內(nèi)大鼠死亡2 只，剩余40 只，將剩余的大鼠全部進(jìn)行尾動(dòng)脈壓測定，血壓＞140 mmHg 大鼠有24只，成模率為60%。

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4 個(gè)組:假手術(shù)組、模型組、卡托普利組(15 mg/kg)、黑加侖籽粉組(2.75 g/kg)，每組8 只，共32 只。各組分別灌胃給予相應(yīng)藥液，假手術(shù)組、模型組灌胃給予等容量蒸餾水，連續(xù)灌胃8 周，每天1 次。給藥8 周結(jié)束時(shí)，無大鼠脫落。

1.6 尾動(dòng)脈壓測定

分別于手術(shù)后4 周、給藥2 周、4 周、6 周、8 周后將大鼠放置于安靜的環(huán)境中，用BP-6A 無創(chuàng)血壓儀測定大鼠的收縮壓，每只大鼠測量3 次，取其平均值。

1.7 血漿中ET-1 含量，血清中NO 含量、SOD 活力及MDA 含量的測定

連續(xù)給藥8 周，測量血壓后，10%水合氯醛麻醉(0.3 ml/100 g)，腹主動(dòng)脈采血8 ml，3500 rpm 離心10 分鐘，測定血漿ET-1、血清NO、MDA 的含量和SOD 的活力，具體操作按說明書要求。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料均以(±s)表示。各組大鼠血壓測定值、血漿中ET-1 含量、血清中NO、MDA 含量和SOD 活力經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)，P 值均＞0.05，即服從正態(tài)分布，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，P 值均＞0.05，即具備方差齊性，故多組間不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測量資料方差分析，同一組不同時(shí)間點(diǎn)，同一時(shí)間點(diǎn)不同組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑加侖籽粉對(duì)腎性高血壓大鼠血壓的影響

多組不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)重復(fù)測量資料方差分析，球形檢驗(yàn)結(jié)果P=0.071＞0.05，滿足了協(xié)方差矩陣球?qū)ΨQ的條件，不需對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正，組間效應(yīng)F=33.746，P=0.000 ＜0.01，說明不同組別的降壓效果有顯著性差異;時(shí)間因素F =34.514，P =0.000＜0.01，說明不同時(shí)間點(diǎn)測定的血壓至少在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上是不同的;交互作用F=14.370，P =0.000 ＜0.01，說明不同組別大鼠的血壓值在不同時(shí)間點(diǎn)上的變化是不同的。

給藥前，經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn) =24.533，P =0.000 ＜0.01 說明各組間大鼠血壓不全相同。與假手術(shù)組相比，模型組血壓明顯升高(P = 0.000 ＜0.01)，與模型組相比，卡托普利組、黑加侖籽粉組血壓均無顯著性差異(P =0.468，0.957＞0.05);給藥后，與模型組相比，卡托普利組在給藥2 周、4 周、6 周及8 周后血壓均明顯下降(P =0.003，0.000，0.000，0.000 ＜0.01)，黑加侖籽粉組在給藥2 周血壓無明顯下降(P=0.189＞0.05)，給藥4 周、6 周、8周后血壓明顯下降(P = 0.000，0.000，0.000 ＜0.01)。與卡托普利相比，黑加侖籽粉組在給藥2周、4 周、6 周、8 周后血壓無顯著性差異(P =0.067，0.537，0.338，0.261＞0.05)，說明黑加侖籽粉和卡托普利降壓效果相當(dāng)?？ㄍ衅绽M與自身給藥前相比，給藥2 周、4 周、6 周及8 周后血壓均明顯降低(P=0.005，0.001，0.000，0.000)，黑加侖籽粉組與自身給藥前比，給藥2 周血壓無明顯下降(P =0.322)、4 周、6 周及8 周后血壓均明顯降低(P =0.004，0.000，0.000)，說明黑加侖籽粉降壓作用較平緩。見表1。

表1 各組大鼠給藥前后收縮壓變化(mmHg，±s，n=8)

表1 各組大鼠給藥前后收縮壓變化(mmHg，±s，n=8)

注:與假手術(shù)組相比，aP ＜0.01;與模型組相比，bP ＜0.01;與給藥前相比，cP ＜0.01

組別 給藥前 給藥2 周 給藥4 周 給藥6 周 給藥8周假手術(shù)組 114.20 ±3.50 112.90 ±3.86 113.63 ±4.34 114.86±3.04 115.99 ±2.10模型組 156.55 ±15.31a 157.76 ±12.49a 158.99 ±11.09a 157.74 ±9.58a 157.85 ±10.61a卡托普利組 152.25 ±11.04 137.89 ±12.14bc 132.22 ±9.29bc 122.63 ±7.52bc 120.10 ±5.93bc黑加侖籽粉組 156.24 ±13.41 149.53 ±16.72 135.40 ±13.60bc 126.32 ±8.48bc 125.28 ±13.15 bc

2.2 黑加侖籽粉對(duì)腎性高血壓大鼠血漿中ET-1 和血清中NO 的影響

各組大鼠血漿中ET-1 含量的比較經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn) =23.716，P =0.000 ＜0.05，即說明各組血漿中ET-1 含量不全相同，兩兩比較采用LSD 法，與假手術(shù)組相比，模型組血漿中ET-1 含量顯著升高(P=0.000 ＜0.01)，說明腎性高血壓能使血漿中ET-1 含量升高;與模型組比較，卡托普利組、黑加侖籽粉組的ET-1 含量均明顯降低(P =0.000，0.000＜0.01)，說明卡托普利和黑加侖籽粉可以降低腎性高血壓大鼠血漿中ET-1 含量;與陽性藥卡托普利比較，黑加侖籽粉組ET-1 含量無顯著性差異(P =0.653＞0.05)，說明黑加侖籽粉和卡托普利降低ET-1含量的效果相當(dāng)。

各組大鼠血清中NO 含量的比較經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=13.250，P=0.000 ＜0.05，即各組大鼠血清中NO 含量不全相同，兩兩比較采用LSD 法，與假手術(shù)組相比，模型組血清中NO 含量明顯降低(P =0.000 ＜0.01)，說明腎性高血壓能使血清中NO 含量降低;與模型組比較，卡托普利組、黑加侖籽粉組的NO 含量均明顯升高(P =0.000，0.000 ＜0.01)，說明卡托普利和黑加侖籽粉可以升高腎性高血壓大鼠血清中NO 含量;與陽性藥卡托普利比較，黑加侖籽粉組NO 含量無顯著性差異(P =0.231＞0.05)，說明黑加侖籽粉和卡托普利升高NO 含量的效果相當(dāng)。見表2。

表2 黑加侖籽粉對(duì)腎性高血壓大鼠ET-1、NO的影響(±s，n=8)

表2 黑加侖籽粉對(duì)腎性高血壓大鼠ET-1、NO的影響(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組相比，aP ＜0.01;與模型組相比，bP ＜0.01

組別 ET-1(pg/ml) NO(μmol/L)23.65 ±6.16 29.37 ±8.20模型組 54.23 ±7.83a 8.53 ±3.34a卡托普利組 27.56 ±9.30b 32.89 ±13.77b黑加侖籽粉組 38.73 ±7.89b 27.68 ±4.59假手術(shù)組b

2.3 黑加侖籽粉對(duì)腎性高血壓大鼠血清中SOD、MDA 的影響

各組大鼠血清中SOD 活力比較經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=9.328，P =0.000 ＜0.05，即說明各組SOD活力不全相同。兩兩比較采用LSD 法，與假手術(shù)組相比，模型組血清中SOD 活力明顯降低(P =0.000＜0.01)，說明腎性高血壓能使血清中SOD 活力降低;與模型組比較，卡托普利組、黑加侖籽粉組SOD活力均無顯著性差異(P =0.110，0.053＞0.01)，說明卡托普利和黑加侖籽粉對(duì)高血壓大鼠SOD 活力可能無影響。

各組大鼠血清中MDA 含量的比較經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn) =57.411，P =0.000 ＜0.05，即各組MDA含量不全相同。兩兩比較采用LSD 法，與假手術(shù)組相比，模型組血清中MDA 含量明顯升高(P =0.000＜0.01)，說明腎性高血壓能使血清中MDA 含量明顯升高;與模型組比較，卡托普利組、黑加侖籽粉組的MDA 含量均明顯降低(P=0.000，0.000 ＜0.01)，說明卡托普利和黑加侖籽粉可以降低高血壓大鼠MDA 含量;與陽性藥卡托普利比較，黑加侖籽粉組MDA 含量與其有顯著性差異(P =0.018 ＜0.05)，說明黑加侖籽粉降低MDA 含量的效果低于卡托普利。見表3。

表3 黑加侖籽粉對(duì)腎性高血壓大鼠SOD、MDA的影響(±s，n=8)

表3 黑加侖籽粉對(duì)腎性高血壓大鼠SOD、MDA的影響(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01;與模型組相比，cP ＜0.01

組別 SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)90.01 ±1.61 2.69 ±0.44模型組 79.10 ±5.93a 8.58 ±0.70b卡托普利組 82.59 ±4.26 4.89 ±0.48c黑加侖籽粉組 83.37 ±3.92 6.04 ±1.45假手術(shù)組c

3 討論

腎性高血壓是一種常見的繼發(fā)性高血壓，其主要病因是腎動(dòng)脈狹窄。由于腎血流量的減少，異常激活腎素血管緊張素系統(tǒng)，導(dǎo)致鈉、水潴留和血壓升高［6］。腎性高血壓大鼠是篩選降壓藥常用的動(dòng)物模型之一，其病理生理與人類高血壓有很多相似之處，且對(duì)降壓藥物的反應(yīng)與高血壓病人較相符，手術(shù)方法較簡單，高血壓穩(wěn)定，故常用來評(píng)價(jià)抗高血壓藥的藥效［5］。本實(shí)驗(yàn)給藥前模型組血壓明顯高于假手術(shù)組(P ＜0.01)，而其他給藥組大鼠血壓與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，且在實(shí)驗(yàn)期間，模型組大鼠血壓持續(xù)穩(wěn)定在一定水平，說明2 K1C 腎性高血壓大鼠模型制備成功。

文獻(xiàn)報(bào)道［7］:對(duì)于對(duì)側(cè)腎功能正常的一側(cè)腎動(dòng)脈狹窄患者，盡管使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素ⅠⅠ受體阻滯劑使患者腎功能減退，因有健康腎代償，仍可考慮用該類藥，總體上有心血管獲益;且國內(nèi)外多數(shù)文獻(xiàn)研究腎性高血壓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均選擇卡托普利作為陽性對(duì)照藥［8-11］。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選用卡托普利作為陽性對(duì)照藥。

目前研究已發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能損傷是高血壓發(fā)病原因之一，調(diào)控內(nèi)皮相關(guān)因子可在一定程度上改善高血壓癥狀［12］。在高血壓病理狀態(tài)下，NO 的合成和釋放明顯減少，而ET 等收縮因子明顯增加，從而使血管舒縮功能失調(diào)引起血壓升高［13］。近年來，研究還發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可能參與了高血壓的發(fā)生發(fā)展的病理過程［14］。其中SOD 是機(jī)體清除自由基的重要酶，能清除超氧陰離子，還能降低脂質(zhì)過氧化物的生成，減少自由基的形成，其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力［15］。MDA 是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，其含量在一定程度上反映了機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［16］。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比黑加侖籽粉組給藥4 周后血壓顯著降低(P ＜0.01)，與自身給藥前相比，給藥4 ～8 周均有降壓作用，且無反彈現(xiàn)象，降壓作用平緩且持久;黑加侖籽粉組ET-1、MDA 含量明顯降低(P ＜0.01)，NO 含量明顯升高(P ＜0.01)，SOD 活力無顯著性增強(qiáng)(P＞0.05)，原因可能與黑加侖籽粉的劑量較低有關(guān)，也可能是黑加侖籽粉對(duì)SOD 無影響，對(duì)于SOD 結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。由此可知，黑加侖籽粉對(duì)腎性高血壓大鼠具有一定的降壓作用，推測其降壓途徑可能是通過抗氧化作用，同時(shí)增加NO、減少ET-1 來保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善血管內(nèi)皮功能從而降低血壓。

黑加侖籽粉雖然顯示出一定的降壓作用，但其給藥劑量和給藥時(shí)間還有待進(jìn)一步確定，黑加侖籽粉是否具有其他降壓途徑及長期用藥是否具有心、腎等靶器官的保護(hù)作用還有待進(jìn)一步的研究。今后需進(jìn)一步開展黑加侖籽粉抗高血壓作用的機(jī)制研究，為開發(fā)一種新的治療高血壓的中藥單方制劑奠定藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)新疆地方藥材黑加侖籽的藥用價(jià)值的充分利用具有重要意義。

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