趙 輝，陳建偉，郭麗娜，夏龍鋼，張春香，任有蛇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物遺傳育種與繁殖，山西 太谷030801)

免疫熒光技術(shù)是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素等) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)) ，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。但組織在4%多聚甲醛及其他固定液固定過程中，組織蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，形成醛鍵和羧甲基而封閉部分抗原決定簇，并會使蛋白與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，也可能會對抗原決定簇產(chǎn)生封閉作用［1］。有研究稱，樣品長時(shí)間固定或保存不當(dāng)會導(dǎo)致其抗原丟失［2，3］。同時(shí)，固定液及固定時(shí)間的不同，對組織抗原的影響也不盡相同。而在試驗(yàn)操作過程中，組織脫蠟、封閉、內(nèi)源性過氧化酶滅活等諸多操作，對抗原簇也有一定的影響。因此，在免疫熒光技術(shù)中，針對不同的組織樣品采取不同的抗原修復(fù)方式，是進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)的前提，也是決定整個(gè)試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵所在。以往對免疫組化的抗原修復(fù)研究較多，但針對免疫熒光的修復(fù)方式鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)對抗原不修復(fù)、胰蛋白酶修復(fù)、不同條件的熱修復(fù)進(jìn)行比較，為睪丸組織免疫熒光抗原修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取10 只健康無疾病的海蘭白成年公雞，按照常規(guī)免疫程序嚴(yán)格免疫。本試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行。

1.2 主要試劑

即用型兔抗人CD90 多克隆抗體、濃縮型SABC- Cy3 試劑盒(兔IgG) 、抗原修復(fù)液、3%雙氧水。以上試劑均購自博士德公司，其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 樣品采集和處理

飼喂10 d 后，采用頸部放血法致死，解剖取睪丸組織樣品，用手術(shù)刀輕輕切成5 mm×5 mm×2 mm 的組織塊，4%多聚甲醛固定24 h 后置于70%乙醇中保存。

1.4 試驗(yàn)方法

睪丸組織塊在常規(guī)脫水、浸蠟后包埋，并制作石蠟切片，切片厚度5 μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟后經(jīng)梯度酒精水化。3%H2O2孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化酶。

采取以下抗原修復(fù)方式: 1) 不修復(fù); 2)抗原修復(fù)液室溫孵育10 min; 3) 將裝有pH 6.0、7.0、8.0 的檸檬酸緩沖液燒杯置于90 ℃的恒溫水浴鍋中，將切片置于檸檬酸緩沖液中，10 min; 4) 配相同的檸檬酸緩沖液，置于97 ℃的恒溫水浴鍋中，將切片置于檸檬酸緩沖液中，10 min。

滴加0.01 mol/L PBS 1∶10 稀釋的正常血清封閉液，室溫10 min。甩去多余液體，不洗。滴加0.01 mol/L PBS 1∶100 的一抗，37 ℃1 h。0.01 mol/L PBS 洗2 min ×3 次。滴加0.01 mol/L PBS 1∶100 稀釋的生物素化二抗，37 ℃ 30 min。0.01 mol/L PBS 洗2 min×3 次。滴加0.01 mol/L PBS 1∶100 稀釋的SABC- Cy3，37 ℃30 min。0.01 mol/L PBS 洗5 min ×4 次。水溶性封片劑封片。Olympus 生物顯微鏡觀察，Image- pro plus 7.0 軟件拍照。

2 結(jié) 果

由試驗(yàn)結(jié)果比較可以得出，未進(jìn)行抗原修復(fù)的睪丸組織蛋白粘連嚴(yán)重，造成明顯的非特性熒光信號，組織細(xì)胞無法分辨(圖1) 。用酶修復(fù)的組織蛋白粘連較少，但非特性熒光信號依然存在(圖2) 。在pH 6.0 的緩沖液中進(jìn)行熱修復(fù)的組織，效果明顯較未修復(fù)的要好。其中，90 ℃中熱修復(fù)的組織細(xì)胞粘連明顯減少，已可區(qū)分開，但著色較淺(圖3) 。97 ℃中組織已可明顯的觀察到單個(gè)細(xì)胞，但曲精細(xì)管組織結(jié)構(gòu)被破壞(圖4) 。在pH 8.0 的緩沖液中熱修復(fù)的組織細(xì)胞可明顯區(qū)分，結(jié)構(gòu)完整。但熒光信號減弱，且著色不均勻(圖5、6) 。在pH 7.0 的檸檬酸緩沖液中熱修復(fù)的組織切片，組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間無蛋白粘連現(xiàn)象，染色均一穩(wěn)定，其中97 ℃(圖8) 較90 ℃(圖7) 中熒光信號更為穩(wěn)定。

圖1 未修復(fù)

圖2 酶修復(fù)

圖4 pH6.0、97 ℃修復(fù)

圖5 pH8.0、90 ℃修復(fù)

圖6 pH8.0、97 ℃修復(fù)

圖7 pH7.0、90 ℃修復(fù)

圖8 pH7.0、97 ℃修復(fù)

3 討 論

免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在，早已不是單純的定性檢驗(yàn)靶蛋白的存在與表達(dá)部位了。而對于免疫組化定量的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化分別是: (1) 試劑標(biāo)準(zhǔn)化; (2) 染色技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化;(3) 結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)化。這就對免疫組化的各步操作提出了新的要求。同時(shí)，關(guān)于抗原修復(fù)方式的報(bào)道也越來越多。1991年Shi 等的研究稱，微波加熱可提高免疫組化的染色效果［4］。原理是在高頻電磁波的作用下使在固定過程中固定液成分與組織中蛋白相結(jié)合的醛鏈打開，從而使被封閉了的抗原決定簇暴露出來。另外，還有高壓鍋抗原修復(fù)，是將組織置于高溫高壓的環(huán)境中，通過高壓高溫作用將組織中因固定液處理而形成的醛鏈打開，使抗原暴露，從而提高染色的敏感性。Fowler 等研究證明，在壓力達(dá)到40 000帕以上用熱修復(fù)加熱石蠟切片，效率可達(dá)80% ～95%，但操作程序繁瑣，設(shè)備要求較高［5］。董玉英等的研究表明，利用超聲波對抗原進(jìn)行修復(fù)的結(jié)果和微波爐中熱修復(fù)的結(jié)果大致相同［6］。本試驗(yàn)比較未修復(fù)、酶修復(fù)和不同pH 檸檬酸緩沖液中熱修復(fù)對試驗(yàn)結(jié)果的影響。

從本試驗(yàn)結(jié)果比較得出，未進(jìn)行抗原修復(fù)的睪丸組織蛋白粘連嚴(yán)重，造成明顯的非特性熒光信號，組織細(xì)胞無法分辨。用酶修復(fù)的組織蛋白粘連較少，但非特性熒光信號依然存在，且熒光信號極弱，這可能是由于抗原簇暴露的不夠充分，致使抗體結(jié)合不穩(wěn)定，導(dǎo)致熒光較弱。在pH6.0 的緩沖液中進(jìn)行熱修復(fù)的組織，效果明顯較未修復(fù)的要好。其中，90 ℃中熱修復(fù)的組織細(xì)胞的粘連明顯減少，已可區(qū)分開，但著色較淺。97 ℃中的組織已可明顯的觀察到單個(gè)細(xì)胞，但可能由于溫度過高的原因，組織結(jié)構(gòu)受到破壞，游離的蛋白結(jié)合熒光染料后致使非特異熒光信號的增加，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確。在pH8.0 的緩沖液中熱修復(fù)的組織細(xì)胞可明顯區(qū)分，結(jié)構(gòu)完整。但可能是由于pH8.0 的緩沖液對組織靶抗原有一定的影響，致使熒光信號減弱，且著色不均勻，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。在pH7.0 的檸檬酸緩沖液中熱修復(fù)的組織切片，組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間無蛋白粘連現(xiàn)象，染色均一，穩(wěn)定，陽性定位準(zhǔn)確，可用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，測定平均光密度等后續(xù)分析。其中，97 ℃的效果較90 ℃的好，可能是高溫可使本試驗(yàn)中組織樣品抗原簇更好的暴露。

本試驗(yàn)證明，抗原修復(fù)是必要的，各修復(fù)組的試驗(yàn)結(jié)果都較未修復(fù)組要好。相比較酶修復(fù)，熱修復(fù)的效果更好，與前人研究結(jié)果一致。在高溫對組織切片結(jié)構(gòu)不影響的情況下，較高的溫度下(97 ℃) 比較低溫度(90 ℃) 的效果要好，蛋白粘連減少，著色穩(wěn)定，非特性熒光信號較弱。這可能是由于高溫使組織蛋白抗原簇暴露的更加全面，進(jìn)而抗原與抗體結(jié)合得更加牢固與穩(wěn)定，得到更好的著色效果。

在相同溫度下，本試驗(yàn)以pH7.0 檸檬酸熱修復(fù)液的效果最好，組織完整，無蛋白粘連，著色穩(wěn)定?，F(xiàn)國內(nèi)所用的檸檬酸熱修復(fù)液一般是pH6.0 的，而羅小平等也報(bào)道，高pH 抗原修復(fù)液在97 ℃下處理的組織能夠很好地檢測到相應(yīng)的靶抗原，且著色均勻，定位準(zhǔn)確［7］。這說明熱修復(fù)時(shí)不同酸堿度的修復(fù)液可能對靶抗原簇的暴露作用有所不同，但其機(jī)制未知。針對不同的組織抗原，需要選擇不同pH 的熱修復(fù)液。但由于影響免疫熒光的因素很多，抗原蛋白的表達(dá)部位及特點(diǎn)也不盡相同，要得出適合特定組織靶蛋白的抗原修復(fù)方式以及熱修復(fù)液pH，還需進(jìn)一步研究。

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