向云龍，張 亮，陳 卓

(河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng)453007)

泛素偶聯(lián)酶2C(Ubiquitin- conjugating enzyme 2C，UBE2C) 能夠優(yōu)先對底物賴氨酸進行多聚泛素化，特異性降解有絲分裂過程中細胞周期蛋白等短周期蛋白從而使細胞退出分裂期，起到調控有絲分裂檢驗點以及控制細胞周期進程的作用［1］。同時，在臨床腫瘤病例以及癌細胞系中，均在染色體上發(fā)現(xiàn)UBE2C 多拷貝以及表達上調，提示UBE2C可以在一定程度上作為腫瘤標記分子［2，3］。研究表明，在細胞系中過表達UBE2C 導致細胞忽略有絲分裂紡錘體檢驗點，失去基因組穩(wěn)定性從而導致腫瘤發(fā)生［4］。但UBE2C在小鼠早期胚胎中的作用尚未見報道。

小鼠以及其他哺乳動物卵母細胞在發(fā)育過程中會逐漸積累mRNA、蛋白質等母源物質，從而達到卵母細胞成熟［5］。這些母源物質對隨后的受精以及胚胎發(fā)育過程至關重要。盡管母源蛋白在卵母細胞向受精卵轉變后，通過泛素化［6，7］或者巨自噬途徑［8］開始逐漸降解，但部分母源物質仍然需要維持一定時間，以渡過合子基因組激活前轉錄的空隙期［9］。如果母源物質過早缺失則會嚴重影響早期胚胎的發(fā)育，導致一系列的發(fā)育遲緩甚至發(fā)育停滯［10］。

既往研究證明，UBE2C 能夠靶向降解多種蛋白，參與諸如細胞周期進程、抗原遞呈、轉錄和細胞凋亡等［11，12］細胞活動。本試驗通過在受精卵時期過表達UBE2C，觀察隨后胚胎發(fā)育進程，從而初步探索UBE2C 在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ICR 小鼠(北京維通利華公司) ; 促性腺激素(寧波第二激素廠) ; 載體(Clontech) 、內切酶、RT- PCR 試劑(日本TAKARA 公司) ; 鼠抗GAPDH 和UBE2C 抗體(臺灣Abnova 公司) ; 反轉錄酶(美國Promega 公司) ; 轉錄、純化試劑盒(德國QIAGEN 公司) ; ECL 底物發(fā)光試劑盒(英國Pierce 公司) ; 其他試劑除特別說明外均購自美國Sigma 公司。

1.2 溶液配制

KSOM 培養(yǎng)液配制: 95 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，0.35 mmol/L KH2PO4，0.2 mmol/L MgSO4·7H2O，0.2 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L 乳酸鈉，25 mmol/L NaHCO3， 0.2 mmol/L丙酮酸鈉，1.71 mmol/L CaCl2·2H2O，0.01 mmol/L EDTA，1 mmol/L L-谷氨酰胺，BSA 1 g/L，酚紅0.001 g/L，青、鏈霉素。

蛋白裂解液配制: 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5) ，150 mmol/L NaCl，1%脫氧膽酸鈉，1% Triton X- 100，0.1% SDS，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L Na3VO4，5 ～10 mmol/L NaF。

1.3 方法

1.3.1 小鼠卵母細胞及胚胎獲取

ICR 雌性小鼠于下午注射孕馬血清促性腺激素(PMSG) ，48 h 后注射人絨毛膜促性腺激素(hCG) 后合籠，次日檢查陰道栓。頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，按超排及見栓時間分別獲取卵巢、輸卵管、子宮置于PBS中，收集卵母細胞及胚胎。

1.3.2 mRNA 提取以及RT-PCR

使用微量mRNA 磁珠提取試劑盒提取mRNA。預制磁珠，加入100 μL裂解液將樣品完全溶解，之后加入20 μL 預制的磁珠，室溫混勻5 min; 置于磁鐵上去除懸液，加100 μL洗滌液A，重懸洗滌2 次; 去懸液后加100 μL洗滌液B，轉移至新離心管，洗滌2 次; 使用13 μL去RNA 酶的水重懸，保持置于冰上。加入預制反轉錄體系，37 ℃反轉錄15 min，85 ℃、5 s滅活反轉錄酶，備用。

1.3.3 免疫印記

加入蛋白裂解液裂解細胞，離心后測定蛋白濃度，取20 μg組織總蛋白(卵母細胞及胚胎則分別各取100 個) 上樣; 120 V 電泳2 h至結束，之后轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h; 一抗1 ∶1 000 稀釋，4 ℃過夜孵育; 次日PBST 洗滌3 次，每次5 min; 隨后二抗室溫孵育1 h，洗滌3 次后使用化學發(fā)光試劑盒顯色、曝光。

1.3.4 細胞免疫熒光化學

收集卵母細胞和胚胎，4%多聚甲醛固定1 h，PBS 洗滌3 次后置于0.1% Triton X-100 中打孔1 h; PBS 洗滌3 次，5%驢血清室溫封閉1 h 后，1∶100 加入UBE2C 抗體4 ℃孵育過夜; 洗滌3 次，每次5 min，二抗1∶200 稀釋，室溫孵育1 h 后，再次洗滌3次后置于PBS 稀釋的染料(Hoechst，2 μg/mL) 中染核10 min，壓片備用。

1.3.5 UBE2C 過表達載體構建

通過兩步法構建UBE2C 和綠色熒光蛋白獨立表達的體外轉錄載體。以卵巢cDNA為模板，用高保真DNA 聚合酶擴增全長的Ube2c ORF 序列，經過EcorI 和BamHI 雙酶切后插入到真核表達載體Pirse2- Zsgreen1中。構建成功的質粒，測序正確后，通過PCR 將ube2c- IRES- GFP 序列擴增，經EcorI 和AscIS 雙酶切連接到可以體外轉錄的經改造后的Pcs2(+)-myc 載體中。陽性克隆測序。正確的克隆線性化后備用。

1.3.6 mRNA 轉錄及顯微注射

使用 mMESSAGE mMACHZNE kit(Ambion) 轉錄UBE2C- eGFP mRNA，使用RNeasy MinElute Cleamup Kit(QiaGen) 純化回收。分別制備固定針外徑約80 μm、內徑20 μm，注射針外徑小于1 μm。單個受精卵注射約5 pL mRNA，之后置于KOSM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

2 結果

2.1 UBE2C 在小鼠組織中的mRNA 與蛋白表達

如圖1 所示，UBE2C 的mRNA 以及蛋白水平在小鼠脾臟組織中的表達最高，在子宮以及卵巢中呈現(xiàn)較高的表達水平。在腦、肌肉、心臟等器官均無明顯表達。提示UBE2C 在小鼠脾臟以及雌性生殖系統(tǒng)中具有重要作用。

圖1 UBE2C 在小鼠組織中的表達模式a，RT-PCR 顯示mRNA 表達水平b，UBE2C 在組織中的蛋白表達水平

2.2 UBE2C 在小鼠卵母細胞以及早期胚胎中的表達圖譜

以前的研究表明，卵母細胞在成熟過程中不斷積累母源物質，這些母源物質在隨后的受精、卵裂中具有重要作用。母源RNA以及蛋白質在卵母細胞向合子轉變過程中被逐漸降解。UBE2C 作為一種泛素偶聯(lián)酶，能夠降解一些短周期底物蛋白。其在小鼠卵巢中也呈現(xiàn)較高的表達水平，通過RT- PCR以及免疫熒光分析UBE2C 從小鼠卵母細胞到囊胚的發(fā)育過程，如圖2a 所示，其mRNA與蛋白質表達水平在受精之后均呈現(xiàn)逐漸上升，在桑椹胚時到達最高，隨后在囊胚時期下降到較低水平(圖2) 。提示UBE2C 可能具有降解母源物質的作用，從而促進小鼠早期胚胎發(fā)育進程順利進行。

圖2 UBE2C 在卵母細胞以及早期胚胎中的表達

2.3 過表達UBE2C 導致2-細胞發(fā)育阻滯

構建UBE2C-EGFP 過表達載體，體外轉錄純化RNA 后，注射入受精卵中并置于KSOM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，之后檢測綠色熒光蛋白表達來選取過表達UBE2C 的胚胎。如圖3 結果表明，與注射去離子水的對照組相比，過表達UBE2C 后所有胚胎均停滯在2-3細胞，對照組均達到桑椹胚時期。提示卵母細胞在注射入UBE2C 后可能發(fā)揮了泛素化E2 酶的功能，對包含母源蛋白在內的一些蛋白進行降解，從而引起胚胎卵裂、合子基因組啟動障礙，導致早期胚胎發(fā)育停滯。

圖3 受精卵過表達UBE2C 并培養(yǎng)2 d 后導致2-細胞發(fā)育阻滯

3 討論

由于在臨床腫瘤以及癌細胞系中，均能檢測到UBE2C 的顯著異常升高［13］，提示著UBE2C 可能與癌變以及細胞惡性轉化相關。Okamoto Y，Pallantep 等 人［14］相繼證明，UBE2C 的高表達加快細胞生長速率，促進增殖，使得UBE2C 在體細胞的細胞周期調控以及癌癥相關作用取得了更多的關注。但對其在胚胎中的功能卻知之甚少。受精卵作為一種全能性細胞，UBE2C 在其卵裂過程中發(fā)揮了什么樣的功能仍然未知。通過構建UBE2C 過表達載體，之后體外轉錄mRNA并注射入胚胎中，我們發(fā)現(xiàn)過表達UBE2C能導致胚胎發(fā)生2-3 細胞阻滯，提示其在胚胎中的功能與癌細胞系中不盡相同。既往研究表明，早期胚胎發(fā)育需要多種母源蛋白的參與，這些母源物質在隨后的卵裂、去甲基化、合子基因組激活等過程中具有重要作用，過早的缺失母源物質均能導致胚胎阻滯在2-細胞到囊胚期間的多種時期。

以上結果表明，在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中，UBE2C 可能通過降解卵母細胞儲存的母源物質，從而確保小鼠胚胎正常發(fā)育。但其在胚胎中對細胞周期的調控作用以及是否影響染色體整倍性仍需要進一步研究。

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