李古月，劉佳鑫，才 謙

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽 110000；2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 110000；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600）

齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物酸水解工藝及水解后苷元含量測(cè)定*

李古月1，2，劉佳鑫1，2，才 謙3

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽 110000；2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 110000；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600）

[目的]確立齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物的最佳水解工藝，并對(duì)水解后的苷元進(jìn)行含量測(cè)定。[方法]通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物的最佳酸水解條件，利用此酸水解條件，對(duì)齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物進(jìn)行酸水解，并采用高效液相色譜法對(duì)水解產(chǎn)物中的3種苷元進(jìn)行含量測(cè)定。[結(jié)果]確定齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物的最佳酸水解條件為：鹽酸-甲醇濃度為4.0 mol/L，水解溫度為78℃，水解時(shí)間為4 h，經(jīng)過HPLC法測(cè)定，水解產(chǎn)物算得到酸法水解后總黃酮苷元的平均含量為58.38%±1.34%，其中木犀草素為12.06%±1.43%，槲皮素為9.66%± 0.32%，芹菜素為36.66%±2.34%。[結(jié)論]該水解方法可有效水解齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物，HPLC測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠，可作為控制齒葉白鵑梅葉總黃酮水解產(chǎn)物質(zhì)量的定量依據(jù)。

齒葉白鵑梅；總黃酮；酸水解；含量測(cè)定

齒葉白鵑梅（Exochorda serratifolia S.Moore.），是薔薇科繡線菊亞科白鵑梅屬植物[1]，主要生長(zhǎng)在遼寧凌源、喀左及河北一帶，其花蕾和幼葉可食用。民間多用其預(yù)防和治療糖尿病。本課題組對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了分離，從中得到蘆丁、木犀草素-7-O-β-D-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-新橙皮糖苷等十幾種黃酮類化合物[2-3]。同時(shí)本課題組對(duì)齒葉白鵑梅葉進(jìn)行了藥理活性研究，證明其確有改善小鼠耐糖量和降血糖的作用[4]。

前期采用大孔樹脂法對(duì)齒葉白鵑梅中的總黃酮進(jìn)行富集和純化，得到總黃酮提取物，采用分光光度法測(cè)得提取物中總黃酮的含量達(dá)到60%左右。由于總黃酮提取物中含有較多的分別以芹菜素、木犀草素和槲皮素為苷元形成的多種苷，本實(shí)驗(yàn)對(duì)這些黃酮苷的水解條件進(jìn)行研究，通過水解使黃酮苷轉(zhuǎn)化成木犀草素、槲皮素、芹菜素3種黃酮苷元，并用高效液相色譜法測(cè)定這3種苷元含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（包括真空脫氣機(jī)、四元泵、柱溫箱、VWD、HP1100化學(xué)工作站）（美國安捷倫科技有限公司），CP225D型電子天平（Sartorius，十萬分之一）。

1.2 試藥 木犀草素、槲皮素、芹菜素對(duì)照品（批號(hào)分別為20120206,20120213,20120314，上海源葉生物科技有限公司），齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物（總黃酮含量為60.51%），水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物水解工藝考察

2.1.1 供試品溶液的制備和色譜條件 供試品溶液的制備，稱取100 mg齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物，加入一定濃度的鹽酸-甲醇溶液，于一定溫度的水浴中反應(yīng)一定時(shí)間，冷卻后過濾，用甲醇定容至50 mL，過0.45 μm濾膜后用HPLC檢測(cè)，通過正交試驗(yàn)確定最佳酸水解條件。

色譜條件如下，色譜柱Promosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-2%冰乙酸梯度洗脫（梯度洗脫程序見表1），柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)267 nm。

2.1.2 水解工藝考察 水解時(shí)間的確定，固定水解溫度為78℃，鹽酸濃度為5.0 mol/L，分別水解1、2、3、4、6 h，用HPLC檢測(cè)，計(jì)算水解率，結(jié)果見圖1。由圖1可知，水解時(shí)間為2～4 h水解效果較好[5-7]。

水解率=（水解后總苷元-水解前總苷元）/水解后總苷元

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program for mobile phase

圖1 水解時(shí)間的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time

鹽酸濃度的確定方法如下，固定水解溫度78℃，鹽酸濃度分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mol/L，水解2 h，用HPLC檢測(cè)，計(jì)算水解率，結(jié)果見圖2。由圖2可知，鹽酸濃度為3.0～5.0 mol/L水解效果較好。

圖2 鹽酸濃度的影響Fig.2 Effect of the concentration of hydrochloric acid

水解溫度的確定如下，固定鹽酸濃度為5.0 mol/L，溫度分別為48、58、68、78、88℃，水解2 h，用HPLC檢測(cè)，計(jì)算水解率，結(jié)果見圖3。由圖3可知，水解溫度為58～78℃水解效果較好。

2.1.3 正交實(shí)驗(yàn) 考察多因素的綜合效果，以L9（33）正交實(shí)驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)（見表2），實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見表3、表4。

圖3 水解溫度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物水解正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Tab.3 The result of hydrolysis flavonoid aglycones from Exochorda serratifolia S.Moore.leaves orthogonal experiment

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表（F0.05=34.402）Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment（F0.05=34.402）

由表3可以看出，R2＞R3＞R1，即在影響水解率的因素中，鹽酸-甲醇濃度的影響程度最大，水解時(shí)間其次，水解溫度最次。從表4也可以看出，PB＜0.05，PA，PC＞0.05，說明鹽酸-甲醇濃度是影響水解程度的主要因素，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將K值進(jìn)行比較，KA3＞KA2＞KA1，KB2＞KB3＞KB1，KC3＞KC1＞KC2，由此可得三因素的最佳水平組合為A3B2C3，即酸法水解最佳工藝條件為：鹽酸-甲醇溶液的濃度為4.0 mol/L，水解時(shí)間為4 h，水解溫度為78℃。

2.2 水解產(chǎn)物中3種黃酮苷元的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱PromosilC18色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-2%冰乙酸（27∶73）；柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)267 nm[6，8-9]。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取木犀草素、槲皮素、芹菜素11.85、10.92、11.70mg，甲醇定容至25mL，搖勻，即得3種對(duì)照品溶液，濃度分別為0.474 0、0.436 8、0.468 0 g/L，備用。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物100 mg，加入4.0 mol/L鹽酸-甲醇溶液50 mL，于78℃的水浴中反應(yīng)4 h，冷卻后過濾，用甲醇定容至50 mL，過0.45 μm濾膜，即得。

2.2.4 線性范圍的考察 取上述3種對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、20 μL，經(jīng)HPLC檢測(cè)后，分別以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，吸收峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程，見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線表Tab.5 Table of standard curve

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取各對(duì)照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算RSD值。結(jié)果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的RSD值均小于2.0%。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、16、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值均小于2.0%。

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品5份，分別測(cè)定木犀草素、槲皮素、芹菜素含量，計(jì)算RSD值均小于2.0%。

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品6份，分別精密加入3種對(duì)照品溶液，測(cè)定含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的平均加樣回收率分別為95.2%±0.76%，94.7%±0.54%， 97.5%±0.54%，RSD值均小于2.0%。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取3批供試品溶液，利用上述確定的水解條件進(jìn)行酸水解。采用HPLC法檢測(cè)水解產(chǎn)物中槲皮素、木犀草素和芹菜素的含量，計(jì)算得到酸法水解后總黃酮苷元的平均含量為58.38%±1.34%，其中木犀草素為12.06%±1.43%，槲皮素為9.66%±0.32%，芹菜素為36.66%±2.34%。

圖4 水解前后樣品色譜圖及各對(duì)照品色譜圖Fig.4 Chromatogram of the sample before and after hydrolysis and reference substance solution

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確立了齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物的最佳酸水解條件。利用該水解工藝對(duì)總黃酮提取物進(jìn)行酸水解，使提取物中多種由木犀草素、槲皮素和芹菜素與糖組成的黃酮苷轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的苷元。同時(shí)，建立3種苷元的HPLC測(cè)定方法，對(duì)3種苷元進(jìn)行含量測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該水解工藝可以有效的水解齒葉白鵑梅葉總黃酮提取物，HPLC法分析樣品中木犀草素、槲皮素和芹菜素3種苷元，方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，回收率高，可作為控制齒葉白鵑梅葉總黃酮水解產(chǎn)物質(zhì)量的定量依據(jù)。

[1]傅沛云.北植物檢索表[M].第2版.北京:科學(xué)出版社，1995:283-284。

[2]才 謙，王靈芝，劉玉強(qiáng)，等.齒葉白娟梅葉化學(xué)成分研究[J].中草藥，2012,43（4）:673-675.

[3]才 謙，王 聰，劉玉強(qiáng).齒葉白鵑梅葉中黃酮類成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（3）：190-191.

[4]王 聰，劉玉強(qiáng)，才 謙.齒葉白鵑梅葉對(duì)小鼠糖耐量的影響及降糖作用研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，2011,17(2):283-284.

[5]楊雪鷗，郁建平，何照范，等.酸水解銀杏黃酮的工藝條件[J].山地農(nóng)業(yè)生物報(bào)，2006,25（2）：181-184.

[6]光 琴，周亞球.HPLC測(cè)定羅布麻葉中總黃酮的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011,17（6）：103-106.

[7]李 博，鄧仕任，賈天柱，等.高效液相測(cè)定酸水解芫花黃酮苷元含量[J].化學(xué)工程師，2010,178（7）：20-21,37.

[8]孟繁姝，劉權(quán)友，高東立，等.HPLC法測(cè)定紫花地丁中槲皮素、芹菜素、木犀草素含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2011,12（1）：48-49.

[9]曹學(xué)松，王錦軍，黃兆文.車前子中槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素的含量測(cè)定[J].中國藥業(yè)，2009,18（12）：32-34.

[10]郭 潔，宋殿榮，宋紅運(yùn)，等.雙黃連凍干粉大鼠血清藥物成分的初步研究[J].2010,27(2):160-162

[11]鄭璐璐，張貴君，王晶娟，等.野菊花藥效組分抗炎的生物效應(yīng)研究[J].天津中醫(yī)藥，2011,28(3):251-253.

[12]陳再興,陳佳琪,朱 旭,等.不同季節(jié)的葎草中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和大波斯菊苷的含量測(cè)定[J].天津中醫(yī)藥，2010, 27(1):74-76.

[13]郭 潔,宋殿榮,王躍飛,等.雙黃連凍干粉HPLC指紋圖譜特征色譜峰的歸屬研究[J].天津中醫(yī)藥，2009,26(6):497-499.

Study on acid hydrolytic conditions of total flavonoids and the determination of flavonoid aglycones from Exochorda serratifolia S.Moore.leaves

LI Gu-yue1,2，LIU Jia-xin1,2，CAI Qian3
（1.The First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110000,China;2.Pharmacy College of China Medical University, Shenyang 110000,China;3.Pharmacy College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China）

[Objective]To establish the acid hydrolytic conditions of total flavonoids and to determine the flavonoid aglycones from Exochorda serratifolia S.Moore.leaves.[Methods]The acid hydrolytic conditions were optimized by the means of orthogonal test and the contents of the flavonoid aglycones were determined by HPLC.[Results]The optimum conditions of acid hydrolysis were:concentration of hydrochloric acid 4.0 mol/L,temperature 78℃,time 4 h.The contents of luteolin,quercetin and apigenin were 12.06%±0.32%,9.66% ±1.43%and 36.66%±2.34%respectively.[Conclusion]This method is accurate and reliable and can be used in the determination of the flavonoid aglycones in Exochorda serratifolia S.Moore.leaves.

Exochorda serratifolia S.Moore;flavonoids;acid hydrolysis;content determination

R284.2

：A

：1672-1519（2014）05-0306-04

2013-12-25）

（本文編輯：高 杉，張震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.05.18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202919）。

李古月（1984－），女，藥師，從事臨床制劑指導(dǎo)工作。