王蘭花* 付白清 曹 莉

（鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212002）

間接ELISA法檢測茵梔黃注射液中的過敏性雜質(zhì)

王蘭花* 付白清 曹 莉

（鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212002）

目的采用“水煮醇沉”工藝生產(chǎn)的茵梔黃注射液可能無法完全去除其植物蛋白等過敏源性雜質(zhì)，本文擬建立間接ELISA方法對國家評價性抽樣中的茵梔黃注射液樣品進行大批量快速篩查。方法建立快速、靈敏的間接ELISA方法檢測方法，采用該方法和中檢所提供的金銀花抗原抗體對茵梔黃注射液中的金銀花源性過敏性雜質(zhì)進行測定。結(jié)果采用間接ELISA法檢測茵梔黃注射液中過敏性雜質(zhì)，線性范圍為1～100 μg/mL（R2=0.996）檢出限約為1 μg/mL，定量限約為6 μg/mL，平均加樣回收率為85.6%，所檢測的110批樣品未檢出對應中檢所提供的金銀花抗體的過敏性物質(zhì)。結(jié)論所建立的間接ELISA方法可以用來快速、高效地檢測出茵梔黃注射液中過敏性雜質(zhì)。

間接ELISA；茵梔黃注射液；不良反應；過敏性雜質(zhì)

茵梔黃注射液用于治療肝炎有顯著的臨床療效，對其有較好的防治作用，能夠提高肝炎患者的生活質(zhì)量，是傳統(tǒng)古方在現(xiàn)代劑型應用中的成功典范，使它在臨床上備受關(guān)注。但隨著茵梔黃注射液在臨床上的廣泛使用，其不良反應的報道也隨之增加，不良反應發(fā)生率居中藥注射劑前列，為中藥注射劑不良反應多發(fā)品種。其引發(fā)的不良反應主要包括過敏性皮疹、用藥局部損害、胃腸道反應[1]、黃疸一過性加重、血液系統(tǒng)損害、神經(jīng)系統(tǒng)損害、過敏性休克[2]等。曾報道有使用茵梔黃注射液后出現(xiàn)呼吸、心跳驟停等不良反應，且因搶救無效導致死亡的病例[3]。此外，使用茵梔黃注射液還可導致高熱（體溫可高達39～40 ℃）、心悸等不良反應。采用“水煮醇沉”工藝生產(chǎn)的茵梔黃注射液可能無法將植物蛋白等過敏性雜質(zhì)完全去除，其可能是造成發(fā)生過敏性ADR的主要原因。因此，有必要對其性質(zhì)作進一步的確認并對其含量進行檢測。ELISA檢測過敏性物質(zhì)的最大優(yōu)勢就是簡便快速，可以在短時間內(nèi)迅速獲得試驗結(jié)果，這在需要快速檢測的情況下具有重大意義。本文采用建立的“間接ELISA法”和中檢所提供的金銀花抗原抗體對茵梔黃注射液中的金銀花源性過敏性雜質(zhì)進行了測定。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG(蛋白含量為400 μg/mL)為GeneScript公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、過氧化尿素均為Sigma公司產(chǎn)品；96孔酶標板為Costar公司生產(chǎn)；酶標儀（Versa MaxTM，Molecular Devices）。茵梔黃注射液110批。

1.2 實驗方法

1.2.1 間接ELISA法試驗步驟

①包被抗原：用包被液將金銀花抗原或樣品稀釋成適當濃度的溶液，包被在96孔聚乙烯酶標板上，每孔加100 μL，同時包被陽性（直接包被兔抗金銀花抗體）和陰性（包被液）對照。4 ℃冰箱冷藏18～20 h后，倒盡板孔中的液體，反復洗滌3次。②封閉：每孔加入5%牛血清白蛋白溶液（溶劑為pH 7.4的PBS溶液）200 μL，37 ℃放置1 h后，倒盡板孔中的液體，反復洗滌3次。③加第一抗體（制備的抗體）：用pH 7.4的PBS溶液將所制抗體血清作適當稀釋，每孔加100 μL，37 ℃放置1 h后，倒盡板孔中的液體，反復洗滌3次。④加第二抗體：用pH7.4的PBS溶液將辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG稀釋（1∶5000），每孔加100 μL， 37 ℃放置1 h后，倒盡板孔中的液體，反復洗滌3次。⑤加底物緩沖液：加TMB-H2O2尿素底物緩沖液100 μL，37 ℃暗處反應約15 min。⑥加終止液：每孔加終止液50 μL。⑦觀察結(jié)果：用酶標儀記錄450 nm的吸光度讀數(shù)。

圖1 抗原濃度（0.125～100 μg/mL）與吸光度值的折線圖

圖2 抗原濃度（0.125～4 μg/mL）與吸光度值的折線圖

圖3 吸光度-抗原濃度標準曲線

1.2.2 兔抗金銀花抗原抗體的純化

取兔抗金銀花抗原（Ⅰ）血清2 mL，加飽和的硫酸銨溶液，使硫酸銨的飽和度達到50%，4 ℃靜置2 h，4 ℃條件下以離心力9000 g離心10 min，棄去上清液；沉淀溶于2 mL水中，加飽和的硫酸銨溶液，使硫酸銨的飽和度達到50%，4 ℃靜置2 h， 4 ℃條件下以離心力9000 g離心10 min，棄上清液；沉淀再溶于2 mL的PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）溶液中，裝入透析袋，4 ℃對100倍的上述PBS溶液透析過夜，其間更換4次透析液。純化后的抗體轉(zhuǎn)移到適當?shù)娜萜髦?，用上述PBS溶液定容至3 mL。

1.2.3 抗原、抗體濃度的確定

將金銀花抗原用包被液稀釋成200 μg/mL的溶液，作為起始濃度，倍比稀釋，分別包被在96孔酶標板上，每孔100 μL，同時包被陰性和陽性對照，4 ℃放置20 h；洗滌后，用5%牛血清白蛋白封閉；洗滌后，加入1.2.2項下純化的抗體，1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀釋，每孔100 μL，按照“1.2.1 間接ELISA法試驗步驟”作方陣滴定。只有當陽性對照呈陽性，陰性對照呈陰性時，試驗結(jié)果才成立。

1.2.4 標準曲線

取包被液稀釋的金銀花抗原（200 μg/mL），倍比稀釋，包被在96孔酶標板上，每孔100 μL，4 ℃冰箱放置20 h，洗滌6遍后，用5%牛血清白蛋白200 μL封閉1.5 h，洗滌3遍，加入1:800的抗體100 μL，洗滌3遍后，加入1:5000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG溶液100 μL反應1 h，洗滌3遍后，加入TMB-過氧化尿素底物液顯色15 min，加入終止液（2 mol/mL硫酸）50 μL，450 nm測定吸光度。以吸光度為橫坐標，抗原濃度為縱坐標做線性回歸。

1.2.5 檢出限與定量限

根據(jù)AOAC的標準，以陰性均值加3倍標準差（n=20）作為本方法的檢測靈敏度，以陰性均值加10倍標準差（n=20）作為本方法的定量限。

1.2.6 精密度實驗

板內(nèi)精密度：取同一樣品包被在同一酶標板上，按照“2.1 間接ELISA法試驗步驟”進行試驗，考察批內(nèi)精密度；板間精密度：取同一樣品，在不同時間，包被在4塊酶標板上，每板5孔，按照“1.2.1 間接ELISA法試驗步驟”進行試驗，考察批間精密度。

1.2.7 加樣回收率試驗

將金銀花抗原加入到已知抗原濃度的茵梔黃注射液中，使其金銀花抗原的加入量分別為4 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL，按照“1.2.1 間接ELISA法試驗步驟”進行試驗，按照接ELISA法的步驟進行實驗，根據(jù)試驗結(jié)果計算平均加樣回收率。

1.2.8 茵梔黃注射液中金銀花源性過敏性雜質(zhì)的測定

金銀花抗原用包被液溶解稀釋成200 μg/mL的溶液并做等比濃度稀釋，茵梔黃注射液用10倍濃度的包被液調(diào)節(jié)pH至9.6，分別加入到酶標板上，每孔100 μL，同時包被陽性和陰性對照，4 ℃冰箱放置20 h；洗滌3遍后加入5%牛血清白蛋白的PBS溶液200 μL，37 ℃封閉1 h；洗滌3遍后加入1:400的兔抗刺五加抗原抗體PBS溶液100 μL，37 ℃孵育1 h；再次洗滌5遍后，加入1∶5000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG PBS溶液100 μL，37 ℃孵育1 h；再次洗滌5遍后，加入TMB-過氧化氫尿素底物緩沖液100 μL， 37 ℃避光反應15 min，加入2 mol/L的硫酸溶液50 μL終止反應，450 nm測定吸光度。

只有當陽性對照呈陽性，陰性對照呈陰性時實驗才成立。根據(jù)AOAC的標準，以陰性均值（X）加3倍標準差（SD，n＝20）的和（X+3SD）作為本方法的檢測限，當待測樣品的測定結(jié)果＞（X+3SD）時，被判為陽性；＜（X+2SD）時，被判為陰性；在（xˉ ±2SD）與（之間時，需要調(diào)整試驗條件重新測試。

2 實驗結(jié)果

2.1 間接ELISA方法的建立

2.1.1 抗原、抗體濃度的確定

試驗顯示，當抗體濃度過高（稀釋度1∶100）時，陰性值明顯偏高；當抗體濃度過低（稀釋度1∶1600）時，陰性結(jié)果差別不大；但抗體濃度較高時，樣品的吸光度值也較高，這可能是由于抗體濃度越高，就越容易與酶標板上的抗原結(jié)合，其反應時間也就越快，所以選擇抗體的最終工作濃度為稀釋度1∶400。

對抗體濃度為稀釋度1∶400的數(shù)據(jù)進行分析，以抗原濃度為縱坐標，吸光度值為橫坐標做折線圖圖1與圖2，通過對圖表的分析，我們得到了最佳的金銀花抗原濃度范圍為2～100 μg/mL。

2.1.2 標準曲線

以吸光度為橫坐標，抗原濃度為縱坐標做線性回歸，得回歸曲線為y＝107.64x-9.13，R2=0.996。金銀花抗原濃度在1～100 μg/mL時，抗原濃度與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。標準曲線見圖3。

2.1.3 檢出限與定量限

根據(jù)AOAC的標準，計算方法的檢出限與定量限。本方法檢出限時吸光度的理論值（cut-off值）=0.0953；定量限時吸光度的理論值=0.148。根據(jù)“標準曲線”項下的實驗數(shù)據(jù)，得到本方法的檢出限約為1 μg/mL，定量限約為6 μg/mL。

2.1.4 精密度實驗

同一樣品在同一酶標板上，20次的RSD為4.01%（n=20），表明板內(nèi)精密度良好；同一樣品，不同時間包被在5塊酶標板上，實驗結(jié)果顯示：各板間吸光度差異較大。故后續(xù)試驗采取每一塊板都做一條隨行標準曲線進行。

2.1.5 加樣回收率試驗

本方法的低、中、高3個濃度的加樣回收率分別為89.8%、86.9%、80.2%，平均加樣回收率為85.6%。

2.2 樣品測定結(jié)果

對抽取的110批樣品進行了測定，結(jié)果未出現(xiàn)ELISA陽性反應，未檢出對應中檢所提供的金銀花抗體的過敏性物質(zhì)。

3 討 論

酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）雖然具有高度的特異性和敏感性，但是其操作包括包被、洗滌、封閉、溫育、加樣、顯色等多個步驟，其影響因素也較多，為了保證實驗的準確性，必須嚴格按照建立的間接ELISA實驗步驟進行試驗。方法中的加樣回收率較低，特別是加入低濃度的標準抗原溶液，主要是由于抗原濃度太低，位于線性范圍的下限，測定結(jié)果的準確性較高濃度差。另一方面，中藥注射液中的成分復雜，樣品中的某些物質(zhì)可能有干擾，也會導致加樣回收率低。經(jīng)過多次試驗發(fā)現(xiàn)，同一樣品在同一塊酶標板上多次測定，其精密度良好；但同一樣品在不同的酶標板上多次測定，其吸光度較大，只有采用每一塊酶標板都做一條標準曲線進行校正后，其精密度方可達到試驗目的。

通過方法學驗證，標準曲線的回歸方程為y=107.64x-9.13， R2=0.996，檢出限約為1 μg/mL，定量限約為6 μg/mL，RSD為4.01%（n=20），低、中、高3個濃度的加樣回收率分別為89.8%、86.9%、80.2%，平均加樣回收率為85.6%。試驗中所建立的間接ELISA法具有較高的精密度、加樣回收率、高靈敏度、特異等特點，可以用于茵梔黃注射液中金銀花源性過敏性物質(zhì)的定性和定量分析。

[1] 胡大豹.茵梔黃致胃腸道反應1例[J].中國實用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志, 2006,13(9):32.

[2] 李明慧,馬烈,陳利軍,等.茵梔黃注射液不良反應臨床分析[J].藥品評價,2006,3(5):355-357.

[3] 鞠琦.靜脈滴注茵梔黃引起過敏性休克2例[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,1998,8(1):23.

Analysis of Allergenic Impurities in Yinzhihuang Injection by an Indirect ELISA Method

WANG Lan-hua, FU Bai-qing, CAO Li
(Zhenjiang First People’s Hospital, Zhenjiang 212002, China)

ObjectiveIn Yinzhihuang injections produced with the method of water boiling and precipitation with ethanol, the allergenic impurities such as plant proteins cannot be removed completely. The objective of this study is to establish an ELISA method for the determination of allergenic impurities in Yinzhihuang injections.MethodAn indirect ELISA method was established for the determination of the allergenic dopants in Yinzhihuang injection, employing the honeysuckle antigen and antibody provided by the National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products.ResultIn the indirect ELISA established, the calibration curve was linear at the concentration range of 1μg/mL-100 μg/mL(R2=0.996).The detection limit was 1 μg/mL while the quantitation limit was 6 μg/mL. The average efficiency of recovery is 85.6%.ConclusionThe indirect ELISA method established in our research could determine the concentration of allergenic impurities in Yinzhihuang injection rapidly with high efficiency.

Indirect ELISA; Yinzhihuang injection; ADR; Allergenic impurity

R286

B

1671-8194（2014）15-0042-03

*通訊作者：E-mail:kfyywanglanhua@126.com